文档介绍：实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化
质粒与载体的基本知识
载体( vecto.):把一个有用的目的DNA片段通过重组
DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。
载体的基本类型:
质粒( plasmid):重组DNA技术中最常见的载体。
入噬菌体( phage
C
BAC(bacterial artificial chromosome
YAC(east artificial chromosome)
质粒的基本性质:
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,
为双链、共价闭合环状DNA分子ccDNΔ,并以超螺旋状态存
在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞
中,它具有自主的复制和转录系统,但质粒的复制和转录需
要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外,质粒还具有编码
某些酶的基因,如对抗生素的抗性等
质粒在细胞内的复制一般有二种:紧密控制型( stringent
control)和松弛控制型( relaxed control)。前者只在细胞周
期的一定阶段进行复制,通常每个细胞内只含有一个或几个
质粒分子;后者在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细
胞中有许多拷贝,一般在20个以上。在细胞培养过程中,加
适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至
1000-3000个。
质粒的不相容性( incompatibility)
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿
主细胞中共同存在,当两种质粒网时进入同
细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞过程
中相互竞争,只有一种质粒占优势。这样,过
几代后,占小数的质粒将丢失,在细胞后代中
只有二种质粒中的一种。这种现象称为质粒的
不相容性( incompatibility)。但利用不同复
制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存
在。
质粒载体的基本特性和要求
、多拷贝、松弛控制吧
2).具有多种常用的限制性内切酶的单切点。
3).能插入较大的外源DNA片段
1).具有容易操作的检测表型。
pBluescript SK(+)质粒载体(pBS)
基本结构
1). ColEl origin
2). Ampicillin
3). Fi origin
.MCS(多克隆位点)
Lacz
2417Pu
Bluescript M13
(296kb
in BLuesrip SK, (ME-), tNo
aerophane s an
90 17 promoter. h Bluescrp KS (M13-M
λ噬菌体(λ phage)
λ噬菌体为一种侵染细菌的病毒,病毒
DNA基因组的二十面体的头部,一个长
的柔韧的尾部
在感染的细胞内,噬菌体既可
以以裂解性的生活周期,也可以是溶原
性的生物周期(基因组整合进宿主基因组)
病毒颗粒内的基因组是线状的,但它的两端是单链
且互补被称作cos末端( cos end,由12bp构成的粘性未
端).一旦进入细胞,两个cos末端就会迅速相互结合,形成
有缺口的环状基因组,细胞的DNA连接酶可修补该缺口
λ噬菌体(λ phage)
,中心区域的大部分对侵染裂
解都是不必要的,可以被不相关的DNA定列所替换,不过
DNM的总长度必须是原长度的75%-105%间即37-52kb
考虑到必要区域,可克隆进入噬菌体的DN片段大约为
20kb(最大为23kb)左右
至今已用λ噬菌体开发出许多插入型和置换型载体
插入型载体:^ZAP,gt10,?gtl1等
置换型载体:AGEM-11,λGEM12, ZEMBL3, ZEMBL4等
与一般的质粒载体不同,λ噬菌体转染前需要利用
噬菌体外壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装
抽提物)在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗
粒
ett arm(20kb)
central st
T7 Transcription Start
(lent arm)
5. GG CCTCA CTGGC CTAAT
CCT AGGAA
(right arm)
5. ICTAG AAGCT IGTCG ACGAA TTCCT
SP6 Transcrption Start
TTCTA TAG
ACC TAAAT GGCCA TITAG G
λGEM11载体(置换型)
品a
c1857S100
lacz
两8
Notes: The direction of transcripti