文档介绍：*
第四章 目的基因的分离与合成
通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”
将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DN***段，称为“目的基因”。
获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物，另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功能的研究
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苏州科技学院生物系 叶亚新
第四章 目的基因的分离与合成
获得目的基因的方法：
限制酶直接分离
从基因组文库中筛选
逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选
人工合成
PCR扩增
基因改造
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苏州科技学院生物系 叶亚新
第四章 目的基因的分离与合成
第一节 限制酶直接分离
一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基因的制备
对已定序列的DNA分子
只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯化所需的DN***断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。
对已知定位的目的基因
只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次即可获得目的基因。
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苏州科技学院生物系 叶亚新
第一节 限制酶直接分离
二、 用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备
采用鸟枪法（shot gun）：
从细菌细胞中分离细菌染色体
用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段
用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体细胞
转化子的选择
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苏州科技学院生物系 叶亚新
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端
全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，
大小不可控
部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载
体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为
转化受体细胞
受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达
的受体细胞
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
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苏州科技学院生物系 叶亚新
鸟枪法操作的改进
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
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苏州科技学院生物系 叶亚新
鸟枪法操作的改进
例如， kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离， - kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DN***段，然后与载体进行拼接
在连接前将DN***段进行分级分离
kb
kb
kb
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苏州科技学院生物系 叶亚新
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识
不能获得最小长度的目的基因
不能除去真核生物目的基因的内含子结构
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苏州科技学院生物系 叶亚新
基因文库的基本概念
基因库（gene pool）
特定生物体全基因组的集合（天然存在）
基因文库（gene library or gene bank）
从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式
基因组文库（含有全部基因）
存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：
cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
第二节 建立基因组文库
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苏州科技学院生物系 叶亚新
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA
用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库
一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA
文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库
第二节 建立基因组文库