文档介绍：一、含义
二、优越性
三、应用
四、定量方法
五、荧光材料
六、结果分析
荧光定量PCR技术原理和结果分析
2021/1/6
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一、含义
实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
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二、优越性
特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。
重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。
自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。
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三、应用
用于核酸的定量如RNA、DNA的定量
用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA变异分析，溶解曲线分析等。
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四、定量方法
1.   标准曲线法的绝对定量
2.   标准曲线法的相对定量 
3.   比较CT法的相对定量
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五、荧光材料
荧光探针和荧光染料
◇  SYBR green I
◇  水解探针TaqMan
◇  分子信标
◇  杂交探针
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SYBR green I
未结合的SYBR green I
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水解探针TaqMan
荧光素
淬灭剂
与目标序列互补
FAM
TET
JOE
HEX
VIC
TAMRA
DABCYL
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探针与目标序列配对时 ，发生荧光共振能量转移 (FRET)
光
能量转移
Taq
游离的探针
荧光基团
淬灭剂
延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号
Taq
发出荧光
光
另一波长的荧光
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分子信标
荧光基团
茎由互补配对的序列组成
环与目标序列互补
淬灭剂
茎(5-7bp)
环（15-30bp）
FAM
Texas Red
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