文档介绍：河北医科大学
博士学位论文
Desert Hedgehog诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞定向分化的研
究
姓名:杨彩侠
申请学位级别:博士
专业:人体解剖与组织胚胎学
指导教师:高福禄
20090401
的净蛭G腥氲悖钊胩教諷细胞是否能促进神经前体细胞分化诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞定向分化的研究方法:将大鼠赴肱咛天大鼠中脑体外接触共中文摘要摘要神经前体细胞琋是具有自我更新和多向分化能力的原始神经细胞,其多向分化能力即在特定因素诱导下能向神经元和胶质细胞分化。将用于神经系统退行性疾病如帕金森病甈的细胞移植治疗具有应用前景。对此目前有三种策略:⑸渖窬Q蜃踊蛏ひ蜃佑盏寄阅贜蛩鹕瞬课磺ㄡ恪分化。嘌蛴郎腘浦驳较嘤δ郧谔迥谙嘤ξ环境作用下分化为具有特定功能的神经元。然而,这种植入的很少能够定向分化为多巴胺珼能神经元,大多数移植细胞分化为胶质细胞。嘌蛴郎窬上赴逋庥盏挤只L囟的能神经元,然后移植到相应脑区发挥治疗效果。已有研究发现,经移植诱导分化能神经元的模型大鼠行为有显著改善。实验证实,将来自睾丸的赴肫渌橹丛聪赴才嘌梢影响这些细胞的生长、发育和分化。但赴泶锏奶囟ㄒ蜃佑绕涫挠盏甲饔没刮醇ǖ馈N4耍静┦垦宦畚哪庖許细胞表达的可能性。本博士学位论文涉及的研究内容主要包括三部分:第一部分:赴源笫笈咛ブ心訬挠Q按俜只饔目的:研究赴耘咛ブ心訬挠Q跋駾苌窬7化的诱导作用。培养和非接触共培养天,免疫荧光检测能神经元标记物酪氨酸羟化酶琓的表达情况。结果:.。而对照单独培养组仅为.。结论:赴芄淮俳肫涔才嘌呐咛ブ心訬ㄏ蚍只
目寺。喝〈笫筘和枳橹琓徊椒ㄌ崛∽躌。甲醛能神经元。第二部分:大鼠蚩寺〖捌湓谔跫赴鸆/、星形胶质细胞和赴吧锨逯械谋泶镉牍泶目的:从大鼠睾丸组织中克隆颍菇ㄕ婧吮泶镌靥疍:感染条件细胞、、、星形胶质细胞和细胞,用免疫荧光细胞化学、:变性琼脂糖凝胶电泳证实所提挥忻飨越到夂螅琒逆转录酶作用下进行逆转录反应。用用附淞趐载体,,挑取白色菌落筛选重组质粒,酶切鉴定后送大连宝生物有限公司测序。婧吮泶镌靥宓墓菇ǎ悍直鹛崛≈柿用限制性内切酶盖校缬痉掷耄A檀炕厥誅片段和线性质粒琓连接酶连接两片段,连接产物转化.,小量提取质粒,限制性内切酶盖屑ê蟠罅提取。侍錖转染细胞及谔跫赴械谋泶铮当细胞融合度达到~%时,将真核表达载体疍复合物加入其中,经秆 C庖呦胞化学的方法证实外源基因在包装细胞系中的表达。待细胞增殖后传代,培养后收集上清并感染条件细胞、、、星形胶质细胞和赴珿秆〉タ寺±┰雠嘌S妹庖哂ü狻⑹担倍量等方法鉴定谏鲜鱿赴械谋泶锊⒛芊置诘培养上清中。结果:目寺〖罢婧吮泶镌靥宓墓菇ǎ核酭通过甲醛交性琼脂糖凝胶电泳观察拇凸兰苖耐暾浴G宄吹、和汀S肦甈扩增得到预期的片段,其大小为。锛游埠罂寺∮,用中文摘要/、虰
进行初步酶切鉴定,有片段插入的克隆继续以载体上的酶和片断内部的酶进行酶切、测序,结果证实插入片段为湫蛄杏ǖ赖囊恢隆;厥詹庑蛘分柿的插入片段,与经虰盖械南咝詐质粒片段连接。转化细菌,小提质粒,用盖校笥业奶带,说明疍载体构建成功。谔跫赴芭嘌锨逯械谋泶铮骸C庖呦赴У姆椒ㄖな低庠基因茉赑跋赴抵斜泶铮凰占《旧锨甯腥咎跫赴、、、星形胶质细胞和赴庖哂ü狻⑹担倍量等方法鉴定后均可见谏鲜鱿赴械母弑泶并能分泌到培养上中清。结论:成功构建了真核表达载体疍茉谔跫赴中高表达并可分泌到培养上清中,具有良好的生物活性。第三部分:对盏即笫笈咛ブ心陨窬疤逑胞定向分化能力的探讨目的研究耘咛ブ心陨窬疤逑赴向多巴胺能神经元分化的诱导作用方法:将实验分为四大组:成功表达奶跫赴鸆和分别与胚胎中脑神经前体细胞接触共培养和非接触共培养;正常纹状体来源的星形胶质细胞和成功表达男切胶质细胞分别与胚胎中脑神经前体细胞接触共培养和非接触共培养;赴泶顳与阻断⒒幼饔茫直鹩肱咛ブ心神经前体细胞接触共培养和非接触共培养;胚胎中脑神经前体细胞单独培养做为对照组。共培养天后,免疫荧光检测能神经元标记物的表达情况。结果:第一组在接触共培养天后偶见阳性细胞,但并无统计学意义;第二组正常星形胶质细胞与接触共培养和非接触共培养天阳性细胞分别为..,..;.;第三组赴泶顳与接触共培养和非接触共培养霻粜韵赴直鹞.;而中文摘要/
:5谒淖镹ザ琅嘌霻阳性细胞为结论:成功构建条件细胞、、、星形胶质细胞与的接触共培养和非接触共培养体系;成功从赴泶顳与阻断⒒幼饔昧椒矫娼⒂盏糔只逑担籇编码的蛋白不能或不能单独诱导与其共培养的定向分化为多巴胺能神经元。关键词:神经前体细胞;多巴胺能神经元;