文档介绍：南昌大学
硕士学位论文
PCR扩增16srRNA基因以快速诊断败血症及分型细菌
姓名:刘宁
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:刘金辉
20100618
摘要败血症是细菌进入血液引起的一种严重的全身感染性疾病,病情进展迅速,病死率高,早期诊断和有效的治疗对病人预后至关重要。目前败血症的确诊主要依靠血培养结果,但血培养方法阳性率低,耗时长,滞后于临床的需求,导致临床诊断困难。在治疗方面,由于不能明确病原体,也只能先期应用大量广谱抗生素治疗,导致耐药性致病菌的增加和病人负担的加重,所以快速诊断败血症并对细菌初步分型是临床亟待解决的难题。蚴窍妇旧迳媳嗦雛喽杂Φ腄序列,存在于所有细菌等原核生物中,但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。蚋叨缺守,但这种保守是相对的,在其保守区之间存在霰湟烨杀淝捅守区交叉排列组成,保守区序列在所有细菌菌种中高度一致,而可变区序列则随菌种的不同有较大的变化。本研究针对蛘庖惶氐悖诒J厍计通用引物,在可变区设计革兰阳性与阴性特异引物,利用际蹩焖僬锒败血症并对致病菌初步分型,为临床诊治提供病原学依据。苎V⒌目焖僬锒在虻谋J厍谏杓仆ㄓ靡铮砸鸢苎V⒌某<妇鸹粕咸亚蚓⒈砥て咸亚蚓⒋蟪ΠO>⒎窝卓死撞⒊η蚓⒏葡萄球菌耙跣远哉站新型隐球菌、白色念珠菌鸵腋尾《窘欣┰觥Q性菌株均得到特异阳性条带,阴性质控未出现阳性条带。优化聚合酶链反应椒ú⑼ü煌ǘ认妇醇觳夥椒ǖ牧槊度,,显著高于血培养方法。检测例败血症患者及例正常人血液标本中的颍胙培养结果进行比较,椒ㄑ粜月%,,,鉴定出了标本中的细菌种属。妇某醪椒中在虻目杀淝直鹕杓聘锢佳粜跃透锢家跣跃匾煨砸物,分别对革兰阳性菌株鸹粕咸亚蚓⒈砥て咸亚蚓⒏咸亚蚓.
肺炎链球菌、化脓性链球菌、肠球菌透锢家跣跃大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌谐彩絇得到特异性对例血培养阳性血液标本进行检测,得到的结果与血培养鉴定结果本研究结果表明,利用┰基因保守区可以快速诊断败血症,其阳性率明显高于血培养方法,分别用革兰阳性和革兰阴性引物进行巢式可快速鉴定出革兰阳性菌和革兰阴性菌,及时为俅仓瘟铺峁┎≡б谰荨关键词:话苎Vⅲ基因摘要条带。一致。
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引言败血症是细菌侵入宿主血液中并繁殖释放多种毒性产物而引起的一种严重危害患者健康的全身感染性疾病。其常见的致病菌主要有革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌,其次为厌氧菌、真菌及一些条件致病菌。败血症无特异的临床表现,病情复杂并且进展迅速,若得不到及时、有效的治疗,其病死率可高达%幢所以快速而准确的诊断对患者的治疗及预后非常关键,其中实验室的检测对诊治败血症有着重要意义。目前败血症的确诊主要依靠血培养结果,但血培养具有许多缺点:首先,阳性率低,这与患者事先用过抗生素治疗或在血液样本采集时细菌浓度不够,血培养方法的敏感性低有关口黄浯危氖背ぃ钌傩枰天的时间,滞后于临床的需求;最后,拖妇⒄婢⒀嵫蹙炔≡搴苣淹ü胀ㄏ妇嘌检出,导致临床诊断困难Ⅲ。在治疗方面,由于血培养结果往往滞后于临床的要求,所以医生通常只能先期应用大量广谱抗生素治疗,或针对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌联合用药,导致耐药率增加、费用加重,并且使厌氧菌、真菌及一些条件致病菌的感染率升高,加重病人病情,所以快速诊断败血症并对细菌初步分型是临床亟待解决的难题。随着分子生物学的飞速发展,越来越多的分子生物学技术被应用于细菌的鉴定和研究,目前研究较多的是。细菌按沉降系数分为郑分别为、。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的约,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的醒芯坎,得到了广泛的细菌蛄锌狻基因是指细菌染色体上编码相对应的蛄校嬖谟谒邢妇娜旧寤蛏希泊嬖谟谝略濉⒘⒖舜翁等原核生物中,但病毒与真菌等非原核生物不含颉基因序列高度保守而被称为“分子化石”。但这种保守是相对的,在其保守区之间存在騦霰湟烨杀淝捅J厍徊媾帕凶槌桑J氐钠畏从α松镂种间的亲缘关系,而高变区片段则能表明物种间的差异,那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物缈啤⑹簟⒅鉴定的分子基础!因为被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”,所以对
基因的研究多集中在评价生物的遗传多态性和系统发生关系方面阳·,如比较嘀衷松锏的核苷酸序列谱后,定义建立了古细菌界,成为细菌分类学中一个科学可靠的指标A硪桓鋈鹊阍蚴羌ㄒ恍┨厥馕⑸,由于分离培养技术的限制,难以获得它们的纯培养进行