大肠杆菌感受态细胞.ppt

文档介绍：DNA的连接和转化
1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源DNA转入受体菌细胞的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化（transformation）：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
转化的方法：
化学的方法:使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过处理将载体DNA分子导入受体细胞；
电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；
将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。
重组DNA转化细菌过程示意图
3．操作步骤
1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
（1） DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液以1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤（约2－3小时）；
（2）每人取1个离心管，转入1 ml培养液，在冰上冷却2-3min，于4℃，6000 rpm离心5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液， ml/管，／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，，冰浴30 min ；
（4）6000rpm离心5min；