文档介绍：分子生物学实验
实验十一目的基因的PCR扩增与检测
第2周分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍
第3周
从植物组织提取DNA
第4周
从动物组织提取DNA
第5周
原核细胞质粒DNA的提取
第6周
核酸的琼脂糖凝胶电泳
第7周
紫外分光光度法测定核酸含量和纯度鉴定
限制性内切酶酶切质粒DNA
第9周凝胶电泳回收和纯化DN***段
第10周细菌感受态的制备
第11周
质粒DNA的转化
第12周
目的基因的PCR扩增与检测
第13周原核蛋白质 [SDS-PAGE电泳
第14周
考试
实验目的:
熟悉PCR方法体外扩增DNA的基本原理,掌握PCR技术的
常规操作,了解PCR引物及参数的设计。利用PCR扩增的方法
获取用于表达的目的基因(CHP6B6)
实验原理
PCR扩增是一种类似于DNA的天然复制过程,以待增的
DNA为模板、在体外由引物介导的酶促合成特异性DN***段的
方法。
DNA聚合式反应【PCR
应体亲:DNA颁板
人过程:95℃叟性
透大
72℃T从引粉开始全或为
第三次循环重
PcR方法体外扩增DNA的基本原理图示
预变性(双链DMA解链)
94°C,5min
PCR的一般过程
变性(94yc,30s-1min)
复性(引物与单链DNA结合)
延伸一总延伸
(72°C,5-10min)
55°C,30s-1min
(72°C,1-3min)
经过30次的循环,扩增的DN***段可达100万倍以上。
引物设计的一般原则
设计和选择高效而且特异性好的引物是PcR的关键
(1)引物长度应为15-30个核苷酸,Tm可按下列简单公式计算
Tm=(G+C)x4+(A+T)+35-2n
(2)引物中碱基的分布应当是随机的,避免出现一连串的单一碱基
或产生二级结构。
(3)G+C碱基的含量在45%-55%左右。
(4)两个引物在3端均必须与模板互补,5端可以不互补。
(5)引物自身连续互补碱基小于4个。
(6)引物之间连续互补碱基亦应小于4。
循环参数
①变性( denaturation)
变性是高温短时,94C,30s-lmin。同时在第一轮循环前先进行94℃预变性
5min,以便使模板DNA完全解链。
②退火( annealing)
实际使用的退火温度要比引物的Tm低5℃。退火温度在55-72℃之间都会得
到好的结果。
③延伸( extension)
般引物延伸是在72℃下进行。对2Kb长的产品扩增时间多采用1min
④循环次数( cycle
一般为30个循环,如果循环次数过多会增加非特异性产物的量。
、实验器材、试剂
:旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,
PCR微量管,双面微量离心管架,PCR仪,台式离心
机,琼脂糖凝胶电泳系统,(灭菌)、
移液器吸头(灭菌)。
:3U/μ1 Tag dNa聚合酶,PCR缓冲液(10×,MgCl2
free),25 omM MgCl2,dNTP,引物,模板质粒,无菌
dd water。dTP混合液(每种25mM),合成的引物,
四、操作步骤
1、反应条件
94℃:94℃
72℃
72℃
30s
90s
55℃
cle
*延伸时间按扩增片断的大小和酶的活性而定,一般以1000
kb/min为标准。
食退火温度根据引物和目的片段来确定。
2、反应体系:(cYP6B6
ml eppendorf管,添加以下各种成分反应液
12. 1 ul
模板DNA
(20-40ng)原质粒进行1:20倍稀释
上游引物(100μmoML)
下游引物100umo)
dNTP mixture(10mmol/L) 2 ul
10倍X缓冲液
q酶
总体积20
,将反应管放入PCR仪中