文档介绍：广东药学院
硕士学位论文
红曲霉丙酮酸脱羧酶基因克隆表达及酶学性质分析
姓名:朱碧云
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:李浩明
2011-05
广东药学院硕士研究生学位论文
红曲霉丙酮酸脱羧酶基因克隆表达及酶学性质分析
专业: 病原生物学
研究生: 朱碧云
导师: 李浩明教授
中文摘要
目的丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase, PDC, )是丙酮酸代谢的关
键酶,它也能催化芳香族氨基酸前体生物转化成光活性α-羟基酮。本研究构建红曲霉
cDNA 文库,筛选得到丙酮酸脱羧酶 PDC 基因,原核表达 pdc 基因,分析并比较红曲
霉重组丙酮酸脱羧酶与野生型丙酮酸脱羧酶的活性与动力学性质的差别。
方法使用 Trizol 提取红曲霉的总 RNA,利用 Creator SMART cDNA 文库构建试剂
盒构建红曲霉 cDNA 文库,筛选丙酮酸脱羧酶基因,利用聚合酶链反应(PCR)技术从
克隆载体 DNA 中扩增出 pdc 基因。对扩增片段和表达质粒进行酶切后连接,连接产
物转化大肠杆菌 DH5α,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,挑取若干单克
隆菌落进行 PCR 鉴定,阳性克隆产物送去测序。将重组质粒 pET-PDC 转化大肠杆菌
BL21(DE3),涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,挑取若干单克隆菌落进行
PCR 鉴定。IPTG 诱导表达阳性转化菌,SDS-PAGE 检测目的蛋白,通过 Ni2+-NTA
agarose 亲和层析纯化后进行稀释复性。
将红曲霉在马铃薯培养基中 30℃培养 7 天,收集菌体,超声波破碎细胞,离心,
取上清。硫酸铵(NH4)2SO4 盐析获得粗酶液,分别经凝胶层析柱 SephadexG-25 与
DEAE 阴离子交换柱纯化蛋白。SDS-PAGE 检测纯度。
分别测重组 PDC 和野生型 PDC 的活性,并分别分析二者的动力学性质,比较两
者的异同点。
I
广东药学院硕士研究生学位论文
结果成功构建红曲酶 cDNA 文库,筛选得到了红曲霉丙酮酸脱羧酶 pdc 基因,pdc
基因的开放阅读框长 1713 bp,编码一个 570 个氨基酸残基的蛋白质,其序列已向
GenBank 提交并被收录,序列号为 HM 191265。重组 PDC 在原核细胞 BL21(DE3)
中高效表达,约占菌体总蛋白的 %,经亲和层析纯化,重组蛋白的纯度达 95 %
左右。偶联酶法测定该酶的活性,二者的最适反应条件均为 pH ,30℃,在最适条
件下测得重组 PDC 与野生型 PDC 比活分别为 U/mg、 U/mg;重组 PDC 的 Km
值为 mmol/L,野生型 PDC Km 值为 mmol/L。
结论红曲霉 pdc 基因可在大肠杆菌中高效表达,红曲霉 PDC 活力较高、稳定性较
好,可用作生物燃料乙醇生产的候选资源。
关键词红曲霉;丙酮酸脱羧酶;克隆;表达;酶学性质
II
广东药学院硕士研究生学位论文
Enzymological Properties of Native and binant
Pyruvate Decarboxylase from Monascus anka 5031
Graduate: Zhu Biyun
Major: Pathogenic Biology
Supervisor: Li Haoming Professor
Abstract
Objective:Pyruvate decarboxylase (PDC, ) is a key enzyme in the metabolism
of pyruvate, and it can also catalyze the biotransformation of aromatic amino acid
precursors into optically active α-hydroxy ketones. In this study, Monascus cDNA library
was constructed firstly, and then the pyruvate decarboxylase gene was screened from it. The
binant plasmid pET-PDC was constructed,