文档介绍：Applied Biosystems 3730/3730xl
DNA Analyzers
DNA测序分析常见问题整理
DNA测序分析常见问题整理
测序结果—峰图
四***谱：每一种颜色对应一种碱基
A
T
C
G
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引物
DNA模板
纯化
困难模板
机器影响
影响测序质量的主要因素
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一、引物对测序结果的影响
① 引物合成时多（少）一个碱基
② 引物不纯
③ 模板上没有引物结合位点
④ 引物二聚体
⑤ 双引物结合
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合成时部分引物
多一个碱基
合成时部分引物
少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信
号的小“尾巴”。
● 原因：合成时引物多一个碱基。
● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信
号的小“尾巴”。
● 原因：合成时引物多一个碱基。
● 对策：重新合成引物
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引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰）
● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质
● 对策：
–建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。
–脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
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模板上没有引物结合位点
● 现象：没有特异性的测序峰图
● 原因：引物无法结合模板
● 对策
重新设计引物
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引物二聚体
● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚体片段小大在100bp左右）
● 原因：引物二聚体未去除干净
● 对策：割胶纯化
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双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套峰
● 原因：模板有两个引物结合位点，同时和两个引物结合
● 对策：重新设计单个引物
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二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯
② 点突变（SNP）
③ 移码突变
④ 杂合子
⑤ 非单克隆
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