文档介绍：学****目的
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：凝胶的选择和准备。
掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
有效分配系数Kav的意义。
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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重点：
1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。
2、分配系数与被分离分子量之间的关系。
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。
性质
方法
分子大小
透析、超滤、密度梯度离心、凝胶层析等
溶解度
等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等
电荷
电泳、离子交换层析等
吸附性质
吸附层析
对配体分子的亲和力
亲和层析
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。
凝胶层析的基本原理
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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凝胶：一些具有立体网状结构
和一定孔径的高分子化合物。
分子大于凝胶孔隙范围的物质：
随着溶剂在凝胶颗粒间流动
分子小于凝胶孔隙范围的物质：
渗入凝胶颗粒的孔隙中
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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凝胶层析的过程
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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凝胶层析过程的数理关系
凝胶干体积Vg
外水体积Vo
内水体积Vi
柱床体积Vt
= Vg + Vo + Vi
洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积。
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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凝胶层析的分配系数
分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。
Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体积Ve有关：
Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化，分离物分子量越大Kav值越小
Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo）
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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葡聚糖凝胶柱层析法的特点
天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。
人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰***凝胶两大类。
葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过
1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶
水的多孔网状高分子化合物。
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15
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5葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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型号
（G-X）
分离范围
（分子量）
适用范围
G25
5000
脱盐、小肽等
G-50
1,500~30,000
低分子量蛋白、多肽
G-75
3,000~70,000
中、低分子量蛋白、多肽
G100
4,000~150,000
中、高分子量蛋白
G150~G200
5,000~800,000
高分子量蛋白
Sephadex的常见规格（分级范围）
X：① 交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子量产品。反之亦然。
② 吸水量。G-25表示：，依次类推。
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