文档介绍：绿色糖单孢菌的发酵及胞外酶的提取北京林业大学生物科学与技术学院 2012-10-20 试验目的?了解发酵应用的广泛性?了解利用发酵罐进行高密度培养的技术?掌握发酵罐的使用原理和方法?掌握酶活测定方法试验原理?绿色糖单孢菌( haromonospora viridis )是一种耐热耐碱的放线菌,产胞外木素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶。?发酵:微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需的产物的过程。?影响发酵的条件:培养基成分、温度、诱导时机及诱导剂、溶解氧、 pH 等。实验材料?菌株:绿色糖单孢菌( haromonospora viridis ) ?培养基?种子培养基:大豆蛋白胨 1%、酵母粉 % 、酶水解酪素 % 、氯化钠 % 、葡萄糖 1% ?发酵培养基:种子培养基中加入诱导物 % xylan pH ~ 灭菌温度: 115 ℃, 30min 试验方法步骤: ?固体培养基挑取单菌落接种于种子培养基中,培养于 45℃、 120rpm ,3d种子液的准备?取一定比例的种子培养基接于发酵培养基中( 1:200 )发酵培养? 10000rpm 、4℃离心 15min 粗酶液提取?木聚糖酶活 xylanase 酶活测定数据分析?生长曲线及产酶曲线?木聚糖酶的比活(包括木糖标准曲线、蛋白含量标准曲线等) 生长曲线及产酶曲线?生长曲线测定: ?在发酵培养过程中,从接种后每 6h取样(3 ml),测定其在 OD 600条件下的吸光度值, 至发酵结束。?以同条件下未接种培养液为空白对照,培养时间为横坐标,菌液的 OD 600吸光度值为纵坐标绘制绿色糖单孢菌在的生长曲线。?产酶曲线测定: ?在发酵培养过程中, 从接种后每 6h取样( 2ml ),分别测定其木聚糖酶和纤维素酶的比活。木聚糖酶活测定方法?制作木糖标准曲线。?⑴用 PH7 的磷酸缓冲液分别配制浓度 1mg/mL 的木糖溶液。?⑵取十支带有刻度的 25mL 试管,分别吸入 0, , , , , , , , , 木糖溶液。?⑶加入磷酸缓冲液,使每支试管的溶液体积为 mL 。?⑷每支试管中加入 mLDNS 溶液,在沸水中反应 5min, 反应后迅速冷却至室温。?⑸向每支试管中加入 10 mL 蒸馏水,在 540nm 处测定溶液的吸光值。木聚糖酶活测定方法?酶活测定方法: 10倍作为待测酶液; pH7 的磷酸缓冲液配制得到 1% 的木聚糖溶液作为木聚糖酶的底物, 在试管中加入 底物, mL 酶液和 磷酸缓冲液,于 60℃下水浴 20min , 加入 1mLDNS 试剂,在沸水中煮 5min, 冷却后加蒸馏水 10mL 混匀后, 540nm 处测定其吸光度。蛋白含量测定方法考马斯亮蓝 G-250 法蛋白质浓度 123456 样品蛋白 ml ( c= )0 蒸馏水 ml 考马斯亮蓝 G- 250 ml 555555 蛋白含量μg020406080100