文档介绍：cDNA 测序和表达谱研究一、 cDNA 测序 cDNA :与信使 RNA 互补的 DNA ,代表了基因的生物学信息。基因:约占总序列的 3%-5% 1991 年, Venter 等: 提出大规模 cDNA 测序研究战略建立了表达序列标签(expressed sequence tag ,EST) 技术。 EST : 长度为 300 ~500 bp的部分 cDNA 对人类基因转录图的制作、全长基因的克隆、基因表达谱的研究等有重要作用。公共数据库 GenBank (.gov /dbEST) UniGene :为了弄清 EST 间的关系,美国国立生物技术信息中心(NCBl) 根据 EST 相似性比较进行聚类分析,形成数据库 UniGene (.gov /UniGene) 当前 cDNA 测序的趋势:由对 EST 的随机测序, 转向全长 cDNA 的克隆和测序。全长 cDNA 是功能基因组学和比较基因组学研究的基础, 有功能意义的全长 cDNA 可以申请专利, 因此,除研究部门外,大药厂和生物技术公司也投入重金进行研究和抢占专利。目前大部分的全长基因有待于克隆。随着人类基因组 DNA 测序的快速进展,众多 EST 可供利用,生物信息学手段的增多和 cDNA 文库构建技术的完善,使得能够获得转录物较长的全长 cDNA 和低转录基因。目前,美国 NIH 启动了全长 cDNA 计划—哺乳动物基因采集计划(Mammalian Gene Collection Project) ,加之其他国家的加入,大大加快了全长 cDNA 的识别和克隆工作。中国的人类基因组计划起步较晚,但坚持“有所为,有所不为”的原则,充分利用自己的资源优势和研究基础, 提出对特殊组织如造血细胞、神经内分泌细胞、树突状细胞、胚胎器官等,或疾病如白血病、肝癌等进行大规模 EST 测序,进行基因表达谱分析,同时完成 1%人类全长 cDNA 的识别和克隆任务。(一)大规模 EST 测序流程并非简单个别 cDNA 测序的累加, 是现代生物技术和现代管理方法的结合, 是生物学与计算机科学的结合。大规模 EST 测序: 多采用流水线作业及计算机辅助管理系统。主要步骤: 1) cDNA 文库构建 2) DNA 测序 3) 信息处理和管理 4) 生物信息学分析 1. cDNA 文库构建研究目的不同—采用不同的 cDNA 文库构建方法。①表达谱分析:常规的 cDNA 文库,如: oligo-dT 引物定向克隆 cDNA 文库或随机引物法构建 cDNA 文库; ②获得更多的全长 cDNA :构建全长 cDNA 文库,如: smart- PCR 和 oligo-PCR ; ③增加 EST 种类:均一化( normalized)cDNA 文库; ④克隆不同状态(药物处理的不同时相、不同病理及疾病的不同发展阶段等)的相关基因:减式 cDNA 文库构建方法。(1) oligo-dT 引物定向克隆 cDNA 文库最常用、大多数 cDNA 文库构建的方法; 多数 EST 来自该文库。主要步骤: RNA 和 mRNA 抽提, 以 mRNA 为模板用 oligo-dT 作反转录引物合成 cDNA 第一链, 在 DNA 聚合酶 I作用下合成第二链, 加上接头后定向装入λ噬菌体。(2) CapFinder-PCR/oligo-PCR 文库主要特点: 利用 mRNA 5 ’帽状结构设计引物, 该引物含有 oligo(G) 以对应于帽状结构的脱氧胞嘧啶,反转录反应时易于合成含有全长的第一链 cDNA , 用5’和3’引物( oligo-dT) 进行 PCR 扩增获得双链 DNA , 装入λ噬菌体。该种文库含有较高比例的全长 cDNA , 也适于样本量较少的组织构建 cDNA 文库。