文档介绍：蛋白酶的发酵
与酶活力测定
学校： 北方民族大学
学院： 生命科学与工程
课程名称： 微生物实验
姓名: 张林锁
学号：
班级： 生物技术102班
组员：郑高琼 唐羽 徐飞 陶昌荣
徐志清 马玉娟 朱海军
实验名称：蛋白酶的发酵与酶活力测定
一、实验目的
目的：1）了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。
2）了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
内容：1）绘制试验菌的生长曲线。
2）蛋白酶的发酵。
3）蛋白酶活力的测定。
二、实验原理
将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵，在30-32 ℃震荡培养48 h，每隔3h取一次样，最后将发酵液离心，取清液检测蛋白酶活力，用生理盐水将沉淀物制成均匀液，制作产蛋白酶芽孢杆菌生长曲线。
蛋白酶在一定的温度与pH条件下水解酪素底物，产生含有酚基的氮基酸(如:酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力
三、实验仪器与材料
菌种：产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源：蛋白酶发酵液；
培养基及试剂：牛肉膏蛋白冻液体培养基；酪素培养基、蛋白酶活力检测试剂
仪器：紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、试剂瓶、接种环、玻璃棒、移液枪、15ml离心管4个、试管12支、PH计、摇床等。
四、实验内容
试验流程：
（2012年5月17日）
实验内容：种子培养液与发酵培养液制备
实验试剂：产蛋白酶芽孢杆菌菌种、种子培养液（不加 琼脂的牛肉膏蛋白胨液体培养基）、发酵培养液（不加琼脂的酪素培养基，酪素减半，其余不变）、1mol/LNaOH、1mol/LHcl
实验器材：250ml锥形瓶3个、玻璃棒、接种环、100ml烧杯3个、胶头滴管1个、封口膜、标签、摇床、电子天平、PH计、10ml移液管、离心管13支等。
实验步骤：
1、按配方配制牛肉膏蛋白冻液体培养基100ml作为种子培养液，装入250ml锥形瓶中
2、按配方配制发酵培养液2份，各100ml装入250ml锥形瓶中（分别记为1号、2号）
3、将实验所用器具（玻璃棒、接种环、移液管、试管）及培养基（250ml，用封口膜包扎）进行高压蒸汽灭菌（、121℃、20min）。
4、待培养基冷却后，在超净工作台上用接种环从斜面培养基上取2环产蛋白酶芽孢杆菌，接种到种子培养基内，放到摇床上，在
31℃摇床培养16h。
第二天(2012年5月18号)
实验内容：发酵培养液接种发酵与取样
实验步骤：
1、种子培养16h后，从摇床上取出种子液，冷却一段时间。
2、在超净工作台用移液管取10ml种子液，放到1号瓶内，（以上午10点为例），摇匀，立即用离心管取5ml样液，记为0h，作为空白管，放入4 ℃冰箱中保藏。用完种子液后立即放入冰箱中保藏，然后将1号瓶进行31℃摇床培养。
3、隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，记上3h、6h、9h、12h，放入4 ℃冰箱中保藏，在才超净工作台上完成取样。
4、提前将种子培养液取出，恢复到室温，22点给2号瓶接10ml种子液，31 ℃摇床培养12h
第三天(2012年5月19日)
实验内容：培养液发酵与取样、测蛋白酶和菌体溶液OD值绘制生长曲线、测酶活力
实验器材：胶头滴管1个、5ml移液管1支、15ml离心管4支、试管12支
实验步骤：
1、在13点开始向2号瓶取样，接下来每隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，分别记上15h、18h、21h、24h后，立即放入冰箱中保藏。
2、同时在13点开始向1号瓶取样，接下来每隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，分别记上27h、30h、33h、36h后，立即放入冰箱中保藏。
3、取完后，将所有的离心管从冰箱里取出，一段时间恢复室温后，测量蛋白酶和菌体溶液在600nm处的OD值，用蒸馏水调0，用0h作空白管
4、蛋白酶活力测定（福林法）（可在等待时间进行操作）
⑴绘制标准曲线：
.a. L-酪氨酸标准溶液:按表A3配制
b. （须做平行试验)， mol/L碳酸钠溶液
、，置于40℃℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿，以不含酩氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度