文档介绍：重组蛋白质纯化技术进展
作者:佚名    科研信息来源:本站原创    点击数: 51    更新时间:2002-11-20
[关键词]:重组蛋白质;分离;纯化;层析;色谱
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    摘要 90年代以来,基因重组技术得到很大的发展,基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%~80%,因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。着重介绍了扩张柱床吸附层析技术,径向膜层析技术,灌注层析技术,液液萃取技术,置换层析技术和金属螯合亲和层析技术近年来进展情况以及它们的优缺点和应用范围。
    近年来随着对蛋白质的研究和生产的需要,基因重组技术突飞猛进,出现了很多基因工程产品,深刻地影响人类自身及其环境。而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%~80%。因此越来越多的生物工作者从事重组蛋白的分离纯化工作。
    、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达,其表达形式一般可分为:(1)细胞外的分泌表达;(2)细胞内可溶性表达;(3)细胞内不溶性表达,即产物以包涵体的形式存在。因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同,采取不同的纯化工艺。例如,当重组蛋白以包涵体形式存在时,就需要对包涵体进行变复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白,其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。
    与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异,即以分子的大小,形状,溶解度,等电点,亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。与此相对应的分离纯化方法参见表1。
    从表1可看出,当前蛋白质的纯化主要是依靠层析和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在,因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来,而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序,以获得较高纯度的制品。
    表1 蛋白质物化性质和分离纯化方法
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蛋白质的分离纯化方法
物理和化
学性质
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分子的大密度梯度离心、超滤、透析、分子筛层析
小和形状等
等电点和制备电泳、等电聚焦层析(或电泳)、离子交
电荷换层析、吸附层析等
溶解度盐溶、盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、液
液萃取技术等
与其它分子亲和层析、金属螯合亲和层析、共价层析等
的亲和性
亲疏水性疏水层析、反相层析等
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    90年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将着重介绍近10年来重组蛋白分离纯化中常用方法的新进展和一些新出现的技术。
    常规液相层析技术的新进展
    液相层析技术是目前蛋白质分离中最常用的技术之一,在基因工程产品下游处理中占有主要的地位。近年来对这项技术的改进主要放在纯化操作系统的性能改进和载体介质的性能提高上。下面就以Amersham Pharmacia Biotech公司为代表,介绍该公司在90年代新推出的操作系统和一些载体。
    近年来该公司在对80年代发展起来的快速蛋白液相层析系统(FPLC)进行了进一步改进,在 90年代推出其新型机型--AKTA系统。其主要特点有:(1)该系统配有计算机及与系统硬件相配合的一套人工智能软件,预装有80种柱的预编程序,其操作菜单简便易于设定,可以使整个系统全自动化工作,极大地提高工作效率。(2)所配有的高压动力双泵体系不仅可以提供以往FPLC系统的中压、低压,而且可以提供HPLC 的高压。因此流速范围较大,可以运用的柱型多,既可以用于实验室的分析摸索阶段,又可以应用于生物工程制品下游的中试和生产。(3)具有自动缓冲液制备功能--BufferPrep。通过这一功能只需准备4瓶存储液体,包括水、酸/碱。盐溶液和缓冲储备液,系统会考虑缓冲液的pKa 值自动对盐及pH进行补偿,可以在线快速制备出各种pH/盐浓度缓冲液。这样用户在开发工艺时,再也不用配置大量不同的缓冲液,大大简化了pH优化问题节省了很多时间。(4)AKTA 系统还具有独特的多波长连续检测器,可以同时提供3个从190~700nm的不同波长作连续检测。利用这一技术,在检测蛋白的同时,可以对具有其它波长吸收的分子进行在线鉴定。
    与AKTA操作系统相配合,90年代Amersham Pharmacia Biotech公司还