文档介绍：加热
变 性
复性
复温
DNA的变性和复性
加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。
解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。
PCR扩增原理
延伸
变性、退火
5’
3’
5’
3’
3’
5’
变性
退火
3’
5’
延伸
变性：加热，使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
退火：溶液温度降至45～65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
PCR的三个热反应过程
温度（℃）
时间（min）
94
72
60
94℃变性（1min）
60 ℃退火（1min）
72 ℃延伸（）
循环1 循环2 循环3
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
PCR的产量
每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。
DNA产量以指数上升，n个循环后，达到2n拷贝。
【仪器耗材与试剂】
（一）仪器与耗材
1. PCR热循环仪
2. 20μL、 200μL 吸头，200μL、500μL EP管，10μL、 50μL、200μL移液器
3. PCR 电泳仪和电泳槽
（二）试剂
10×PCR Buffer；
MgCl2, 25 mmol/L；
dNTP（ 其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为10 mmol/L ）；
正向引物与反向引物（10 μM/L）；
Taq DNA聚合酶（1U/μL）；
DNA模板 （小鼠基因组DNA，100ng/μL ， 反转录cDNA）；
ddH2O
【实验步骤】
1. mL Eppendorff 管内配置20 μL反应体系：
反应物
体积（μL）
dd H2O
12
PCR缓冲液 （10×）
2
MgCl2 （25 mmol/L）
2
dNTP （10 mmol/L ）
正向引物 （ 10 μM/L ）
反向引物 （ 10 μM/L ）
Taq DNA聚合酶
1
模板DNA
1
2. 按下述程序进行PCR扩增:
1） 94℃ 预变性 3 min；
2） 94℃ 变性 1 min；
3） 55℃ 退火 30 sec；
4） 72℃ 延伸 30 sec；
5） 重复步骤2~4, 34次；
6） 72℃ 延伸 5 min；
7） 4 ℃, 3min.
3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制2％琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。