文档介绍：第四章 目的基因的获取
目的基因：
准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第四章目基因获取
第四章目基因获取
结构基因的组成
转录启动区
核糖体识别区
编码区
转录终止区
起译码ATG
开读框
休止码TAG、TAA、TGA
第四章目基因获取
目的基因的获取方法
1、直接分离法
2、基因文库分离法
3、PCR分离法
4、化学合成法
比较各种方法获得目的基因的优缺点
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第一节 直接分离法
一、限制性内切酶法
用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
酶切
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由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。
1. 优点
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
第四章目基因获取
适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.
应用对象
1、对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DN***断，与适当载体连接。
2、对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。
3、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。
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二、随机片断化
1. 限制性内切酶局部消化法
控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
① 内切酶识别位点的碱基数
影响所切出的产物的长度和随机程度。
（1）限制性内切酶的选用原则
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1）4bp的内切酶
平均每46（4096）bp一个切点。
2）6bp的内切酶
平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
② 内切酶粘性末端
能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
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2. 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
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