文档介绍：分子克隆技术
系列一
利用质粒载体克隆水稻DNA片段
CIAP去除5‘磷酸
外源DNA
限制性内切酶酶切
5‘P
3‘OH
5’P
3‘OH
5’P
5’P
3‘OH
3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
5’OH
3’OH
限制性内切酶酶切
多克隆位点
3’OH
载体必备条件:
是一个复制子;
载体在受体细胞中能大量繁殖,其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增;
有1到几个限制内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;
具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞,并据此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来。
基因克隆相关载体:
Plasmid
Cosmid, Fosmid
P1
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial Chromosome)
BIBAC (Binary-BAC)
TAC (petent Artificial Chromosome)
质粒的基本特点
质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子,大小在1-20kb之间,是双链闭合环状DNA分子,具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中,也可整合到细菌染色体上。质粒在细胞内的复制可分为严谨型(只在细胞周期的一定阶段进行复制,一个细胞内只有1至几个拷贝)和松弛型(细胞周期中随时可以复制,拷贝数较多,一般在细胞内有20个以上)
的pSC101是第一个用来作为克隆载体的质粒,其包含一个EcoR I 酶切位点及四环素抗性基因(tetr )
pBR322是最早被广泛应用的克隆载体之一,它包含ampicillin和tetracycline抗性基因和多种限制性内切酶的单一切点。许多第二代、第三代的克隆载体都是从pBR322衍生而来。
实验一、质粒的抽提
 
实验目的:掌握减法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用
实验材料:含有pUC18载体的大肠杆菌
实验步骤:
1. 细菌培养物的生长
2. 细菌的收集及裂解
3. 质粒的沉淀
细菌培养物的生长
从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中,培养至对数生长后期即可(松驰型质粒〕。严谨型质粒(拷贝数较低)可采用绿霉素扩增的办法来扩增质粒;
细菌的收集及裂解:
通过离心收集菌体;细菌的裂解可采用离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法。(具体采用何种方法取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法)