文档介绍：第八章基因工程菌培养
一、概述
基因工程菌生产的产品主要有二类,蛋白质和非蛋白质。
基因操作:
敲除或插入基因片段、增强启动子——代谢工程
基因插入载体,转化工程菌
蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载体(如质粒)上,然后转入宿主菌,表达外源蛋白。
现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这种方法构建重组菌
非蛋白质产物大多可以通过代谢工程,改造细胞的一些基因,如在细胞中插入编码酶的DNA,产生新的途径或增强某一途径,从而得到新的化合物或增加产量。
细胞因子、疫苗、酶
产品最主要的用于疾病的诊断和治疗,此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。
产品特点:要求高纯度。如果不纯,病人可能产生的强的免疫反应或副作用这对人是灾难性的。
有的蛋白转译后还要进行修饰,如糖基化、磷酸化后才有活性。
附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全,降低成本并不重要。
二、宿主-载体系统
构建基因工程菌,必须选择宿主和表达系统
要求:翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全, 列入FDA表中
常用的宿主系统有:大肠杆菌
G+细菌
低等真核细胞
哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰,最普遍选用大肠杆菌作为宿主。
优点:
人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作;
大肠杆菌有相当高的生长速率,并能长到高细胞浓度(50g/l);
大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内,当这些蛋白达到高浓度时,会被水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋白是不折叠的,不折叠的蛋白没有生物活性,必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性。在一些情况下,细胞内蛋白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。
2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种,它是G+菌,它没有外膜,并且能把蛋白分泌(excretion)到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。
枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶,会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难,质粒稳定性也比较差,所以在使用上有较大的限制,
3、低等真核细胞
酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等
优点
生长快最大生长速率是大肠杆菌的25%
个体大酵母比最大的细菌大,容易从发酵液中回收。
有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。
缺点酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难,外源蛋白分泌到胞外也有限。
只能简单糖基化。
当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时,要用动物细胞组织培养来达到。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列,而且所有转译后处理(修饰)与在整个动物中相同,在某种情况下可能转译后修饰有些不同,但它可提供最接近于天然副本的产物,此外多数产物可以分泌到胞外。
但动物细胞生长缓慢,培养基价格昂贵,蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO(中国仓鼠卵巢细胞)。