文档介绍：凝胶过滤法使蛋白质脱盐
实验目的
学习凝胶过滤法分离纯化物质的原理与操作技术。
实验原理
葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)具有网状结构,小分子物质能进入其内部,而大分子物质却被排阻在外部,当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同相对分子量被分开。
葡聚糖凝胶是葡萄糖通过α-1,6-糖苷键形成的葡聚糖长链,与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联而成的具有三维结构的多孔网状结构物。
在合成凝胶时,控制环氧氯丙烷的用量,可以制成网孔大小不同的葡聚糖凝胶,从G-10~G-200。G后的数字代表每克干胶充分溶胀后吸水的克数×10,也反映了凝胶网孔的相对大小,数字越小,其溶胀后的网孔越小。一般G-10~G-50适用于蛋白质与小分子或无机盐的分离,G-75~G-200适用于分子质量大于10000Da的蛋白质的相互分离。
本实验是用G-25使蛋白质与硫酸铵分离。
蛋白质混合物上柱样品上柱后, 小分子后洗脱下来
小分子进入微孔,
大分子不能进入
材料与试剂
纳氏试剂:HgI2 18g溶于无离子水中,稀释至50mL,加入6mol/L NaOH 50mL,静止后取出清液储存于棕色瓶中。
蛋白质-(NH)2SO4溶液:%牛血清蛋白、% (NH)2SO4和10%蔗糖混合溶液。
实验步骤
1 溶胀凝胶:用去离子水浸泡Sephadex G-25凝胶24h以
上或用去离子水沸水浴溶胀约2h。
2 凝胶装柱:将溶胀的凝胶轻缓倒入柱中,使其自然沉
降,沉降后凝胶柱的高度为柱高的3/4~4/5切柱床面平整,
。
3 洗柱:除杂,一般洗脱液体积为柱床体积的2~3倍。
4 加样洗脱:,取样器尖头沿管壁伸到床
面之上,慢慢将样品加到凝胶床面上。拧松夹子,待