文档介绍：第六节基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制
改善基因工程菌不稳定性的策略
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性, 这种
不稳定性具有下列两种表现形式:
结构不稳定性
重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰,导致其表
观生物学功能的丧失
分配不稳定性
整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸(curing)
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生
应激反应:关闭合成途径,启动降解程序
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配
这是重组质粒逃逸的基本原因
受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
基因工程菌的稳定性
重组质粒的逃逸率
当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时,培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒,这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。
重组质粒逃逸的原因有:
高温培养、表面活性剂(SDS)、药物(利福平)、染料促使重
组质粒渗漏
受体细胞中的核酸酶降解重组质粒
重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配,细胞所含重组质粒拷贝
数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性宿主的选择
外源基因整合到宿主染色体上
培养基
生长速率
发酵工艺限制性基质
温度
pH 和溶氧
外源基因表达
基因工程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统
以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括:
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中
其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞
正确设置载体上的多克隆位点
禁止 DNA 片段插在稳定区内
将受体细胞的致死性基因安装在载体上
同时构建条件致死性的相应受体系统,如大肠杆菌的 ssb 基因
(DNA 单链结合蛋白编码基因)
基因工程菌的稳定性
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性
微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培
养基中培养时,由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质,
微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。
基因重组菌的比生长速率与培养环境有关,如温度,pH,溶氧,限制性营养物质浓度,有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下,限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的,经过一段时间的培养,微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
培养条件对基因工程菌稳定性的影响