文档介绍：实训九病毒的血凝及血凝抑制试验(微量法)
目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验(微量法)的操作方法及结果判定,明确其应用价值。
仪器及材料 、 PBS或生理盐水、1%鸡红细胞悬液、新城疫病毒液、新城疫病毒待检血清、微量血凝板(V型96孔)、微量移液器(带吸头)、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。
方法与步骤
(一)病毒的血凝(HA)试验(实验视频六)(实图9-1)
%鸡红细胞悬液的制备采成年健康鸡血,加入有抗凝剂(%枸橼酸钠液)的离心管中,、 PBS磷酸缓冲盐水洗涤3~4次,每次以2000r/min离心3~4min,最后一次5min。每次离心后弃去上清液,并彻底去除白细胞,最后用PBS稀释成1%红细胞悬液。
(实表2)
实表2 病毒血凝试验操作术式(以新城疫病毒为例) 单位: μl
孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
PBS或生理盐水
新城疫病毒液
病毒稀释倍数
1%鸡RBC悬液
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 100
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 -
弃50
21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 211 对照
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
振荡1min,室温(18℃~20℃)下作用30~40min,或置37℃恒温培养箱中作用15~30min观察结果
结果举例
+
+
+
+
+
+
+
±
±
-
-
-
(1)用微量移液器向反应板每孔分别加PBS 50μl。
(2)换一吸头吸取50μl病毒液,加于第1孔的PBS中,并用移液器挤压3~5次使液体混和均匀,然后取50μl移入第2孔,混匀后取50μl移入第3孔,依次倍比稀释到第11孔,第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。第12孔不加病毒抗原,作对照。
(3)换一吸头吸取1%红细胞悬液依次加入1~12个孔中,每孔加50μl。
(4)加样完毕,将反应板置于微型振荡器上振荡1min,并放室温(18~20℃)下作用30~40min,或置37℃恒温培养箱中作用15~30min取出,观察并判定结果。
“+”表示红细胞完全凝集。红细胞凝集后完全沉于反应孔底层,呈颗粒状,边缘不整或锯齿状,而上层液体中无悬浮的红细胞。
“-”表示红细胞未凝集。反应孔底部的红细胞没有凝集成一层,而是全部沉淀成小圆点,位于小孔最底端,边缘水平。
“±”表示部分凝集。红细胞下沉情况介于“+”与“-”之间。
新城疫病毒液能凝集鸡的红细胞,但随着病毒液被稀释,其凝集红细胞的作用逐渐变弱。稀释到一定倍数时,就不能使红细胞出现明显的凝集,从而出现可疑或阴性结果。能使一定量红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度,或称血凝价。
(二)病毒的血凝抑制(HI)试验(实验视频七)
采用同样的血凝板,每排孔可测1份血清样品。
,确定病毒的血凝价,用PBS稀释病毒,使之含4个血凝单位的病毒。稀释倍数