文档介绍：实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
相关基础知识
凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析,是一种按分子大小分离物质的层析方法,广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中,然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中,只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中,因而以较快的速度首先流出层析柱,而小分子则能自由出入凝胶颗粒中,并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡,因此就要花费较长的时间流经柱床,从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致,且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外,而对某些小分子化合物则不能排阻,但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav(被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(Vo)及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关,即:
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下,Vt和Vo都是恒定值,而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大,Kav值小;反之,则Kav值增大。因此,在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时,由于流动相的作用,这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中,柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生,其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出,分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来,检测后分段合并相同组分的各管流出物,即等于把分子量不同的物质相互分离开了。其分离效果受操作条件(如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等)的影响,而最直接的影响是Kav值的差异性,Kav值差异性大,分离效果好;Kav值差异性小,则分离效果很差,或根本不能分开。
分配系数Kav既是判断分离效果的一个参数,又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知,只要测出床体积Vt 和外水体积Vo 以及洗脱体积Ve,即可计算出Kav值。而凝胶床总体积Vt可用二种方法得到:
计算法:根据层析柱体积计算总体积,可用下列公式表示
Vt= pr2h
式中r为层析柱半径;h为凝胶床高度;p为圆周率。在用此公式计算凝胶床总体积时,须精确地分段测量,以防内径不匀造成误差。另外还须注意到,在层析过程中,尤其是软胶的操作压力要小,以防凝胶床的高度降低。
测量法:由凝胶床的组成可知,床体积Vt等于外水体积Vo、内水体积Vi与凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即
Vt= V0+Vi+Vg
因Vg与Vt相比很小,可忽略不计,故
Vt= V0+Vi
而Vo和Vi可通过实验测得:当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时,其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔内,而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo (Kav=0)。然而,溶液中的分子小于凝胶孔径下限者能自由进入凝胶网孔内,凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积,即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。