文档介绍：〔Ⅱ〕实验部分
实验一蛋白质含量测定法
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:
CH2COOH
| + 3H2SO4 ® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
NH2
2NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH ® 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白
氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,。
五种蛋白质测定方法比较如下:
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
凯氏定氮法
(Kjedahl法)
灵敏度低,~ ,误差为±2%
费时
8~10小时
将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定
非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离)
用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长
双缩脲法(Biuret法)
灵敏度低
1~20mg
中速
20~30分钟
多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物
硫酸铵;
Tris缓冲液;
某些氨基酸
用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似
紫外吸收法
较为灵敏
50~100mg
快速
5~10分钟
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收
各种嘌吟和嘧啶;
各种核苷酸
用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正
Folin-酚试剂法(Lowry法)
灵敏度高
~5mg
慢速
40~60
分钟
双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原
硫酸铵;
Tris缓冲液;
甘氨酸;
各种硫醇
耗费时间长;操作要严格计时;
颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法)
灵敏度最高
1~5mg
快速
5~15分钟
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm
强碱性缓冲液;
TritonX-100;
SDS
最好的方法;
干扰物质少;
颜色稳定;
颜色深浅随不同蛋白质变化
二、双缩脲法(Biuret法)
(一)实验原理
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。
H2O
O=C C=O
HN NH
R-CH CH-R
O=C Cu C=O
HN NH
R-CH CH-R
H2O
紫色络合物
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。