文档介绍：核酸分子杂交
定义
具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。
种类
按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种:
固相杂交应用较广,包括Southern blot、Northern blot 、Spot blot、in situ hybridization等。
DNA Hybridization
De- and re-nature DNA DS using temperature variation
一. 核酸探针制备及标记
核酸探针(probe)是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段,因而可检测样品中特定的基因序列。
探针
根据核酸探针的来源及性质有双链DNA、单链DNA、单链RNA和人工合成的寡核苷酸探针等。用于分子杂交的核酸探针均须进行标记,带有示踪物,与靶基因杂交后,才能检测显示出杂交体信号。标记物有放射性同位素和非放射性同位素两大类。3H、35S和32P是三种较常用的放射性同位素标记物,非放射性同位素标记物较常用的是生物素(biotin)、地高辛(digoxigenin,DIG)和荧光素等。
(一)缺口平移标记法(Nick translation)
[原理]
在未标记的DNA探针溶液中加入一定量的胰DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ),DNA聚合酶Ⅰ和标记的三磷酸核苷。DNaseⅠ在DNA双链上随机切开若干个带有3′-OH末端的单链缺口,而DNA聚合酶Ⅰ发挥5′→3′核酸外切酶活性从5′-末端
标记
切除单核苷酸;同时又具有从5′→3′的聚合作用,将标记的三磷酸核苷按5′→3′方向重新修补缺口,此新合成DNA的两条链均匀地被掺人标记物。该法适合于各种环状或线性双链DNA探针标记。
标记
[试剂]
1.      10×缺口平移缓冲液
mol/L Tris-Cl()
 
mol/L MgSO4
 
mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)
 
500 μg/ml 牛血清白蛋白(BSA)
标记
2. 未标记脱氧三磷酸核苷(dNTP)溶液:dTTP、dCTP、dGTP溶于50mmol/L Tris-Cl ( pH ),终浓度为20mmol/L。
3. DNaseⅠ(10ng/ml):溶于含 50μg/ml BSA、1mmol/L DTT 、50%(V/V)乙二醇的溶液。
4. DNA聚合酶Ⅰ(5U/μl):溶于50mmol/L Tris-Cl ( pH )。
5. [α-32P]dATP:3000Ci/mmol、10μCi/μl。