文档介绍：植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析
植物DNA提取
DNA提取原则
保证DNA结构的完整性
排除有机溶剂和金属离子的污染
排除其它核酸分子的污染
蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度
纯化后不应存在对酶抑制性的物质
植物DNA提取的方法
CTAB法
SDS法
煮提法
--植物DNA提取的经典方法
DNA提取的基本步骤
材料的准备(新鲜或冷冻保存)
细胞的裂解(液氮研磨,释放内容物)
DNA的分离与纯化(酚氯仿抽提)
DNA的沉淀与洗涤(2V无水乙醇或2/3V异丙醇)
DNA的干燥与溶解(ddH2O或TE)
CTAB法流程
离心洗涤
植物材料
裂解液
上层溶液
液氮研磨
抽提
细胞裂解
干燥溶解
沉淀
CTAB提取液主要成分
CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵,是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
Tris-HCl(): 提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏。
EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。
NaCl: 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中。
,。
µl预热(95℃)×CTAB缓冲液,然后65℃温浴20~60min。
,冷却后加入600µl 氯仿:异戊醇(24:1)混合均匀,然后10000rpm离心10min,取出后吸取上清液到另一新的EP管中。
,冰浴至DNA丝状物出现。
,倒掉上清液。
µl75%乙醇洗涤,放置30min。
,室温下吹干DNA。
µlTE溶解DNA。
-10ul电泳检测提取效果
10.-20℃下贮存备用
CTAB法步骤
注意事项
1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 在提取过程,应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。
DNA的质量检测
电泳
带型单一无拖尾现象
点样孔无残留杂质
OD值测定
DNA纯品的OD260/,若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/-,若比值较高说明有残余的盐存在。