文档介绍：核酸杂交检测技术
核酸杂交技术是分子生物学的基木技术之一,近年来正逐渐用丁病毒病的特界、敏感和快速诊断。杂交的 基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待 测样品中的病毒核酸，杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号，则说明样品中存在病毒核酸，进而证明病 毒感染的存在。待测的病毒核酸可以从病料屮提取，也可以从纯化的病毒粒子提取。提取后可在膜上与探 针杂交（固相杂交）。或直接在试管的杂交液屮杂交（液相杂交），此外，也可直接在组织切片或细胞涂片上 对细胞中的病毒核酸进行杂交（原位杂交）。下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病毒诊断的几种杂交 方法。 （一）建立杂交体系 核酸杂交是多种环境因素与二条互补核酸链综合作用的结果,它有较
高的技术要求。了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系，获得理想结果的基础。1、温度 杂交反应中，双链核酸的变性与复性主要是温度控制的。选择适当的杂交和洗膜温度是实验成败最关键
的因素之一。杂交反应通常在低于解链温度（T m值）15-25-C的条件下进行。T m值受核酸链组成 （G+C）、溶液的离子强度、pH值及反应体系是否含变性剂等的影响。在杂交体系不含变性剂的情况下,DNA 之间的杂交反应通常在68°C进行，当含50%变性剂甲酰***，则在42C进行。2、pH值 杂交体系的pH在 5〜9的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在pH6 5〜7 5之间进行。较高的pH值产生更严格
的杂交条件。 3、盐离子浓度 体系中往往加入单价离子的盐，因为单价阳离子与核酸链上的磷酸基
团发生静电反应，所以能降低核酸链之间的静电排斥，维持双链DNA的稳定性。盐浓度增加,稳定性提高。 杂交体系中通常采用6倍SSC（1倍SSC为0 15 mol/L NaCl和0 015mol/L柠檬酸钠，pH7 0）缓冲
液。 4、变性剂 杂交体系中加入变性剂可降低T m值，所以杂交可在更低的温度下进行。常用变性
剂是甲酰***。 5、DNA浓度 浓度愈高，复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针，还应尽量减 少杂交体积，一般每百cm 2滤膜用2 5ml杂交液。 6、探针长度 溶液中DNA复性率与片段长度 的平方根成正比。所以用长的探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针，以减少探针进入细 胞并扩散到靶核酸的阻力。 7、硫酸葡聚糖 在水溶液中，此化合物表面可吸附DNA探针分子，从而浓 缩探针，促进二条核酸链间的缔合。其10%的浓度可提高杂交速度10-100倍。使用硫酸葡聚糖可能导致
背景加深,所以一般在探针浓度过低的情况卜〔才使用。 8、杂交时间 它受探针的长度与浓度、反应体
积等因素的影响,较短的探针、较高的探针浓度和较小的杂交体积，需要较短的杂交时间。一般来说，杂交 时间通常在2〜16小时。 9、预杂交 在杂交前进行预杂交，封闭非特异的DNA结合位点，降低非特异
杂交,是杂交的前提。常用的封阻试剂有非特异性的DNA （鮭鱼精子DNA或小牛胸腺DNA）和大分子化合物（聚 蔗糖、聚乙烯毗咯烷***、牛血清白蛋白、脱脂奶粉等）。 10、碱基错配 杂交中碱基错配将明显提高
杂交本底,从而影响杂交结果的判定。因此杂交可在更为严格的条件下进行,如低于T m值15C的温度下 杂交。 11、漂洗