文档介绍：生物化学实验
中南民族大学实验教学中心
二零零六年三月
目录
实验一糖类的定量测定
实验二纸层析法分析氨基酸
实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
实验四酵母RNA的提取及含量测定
实验五外界因素对酶活性的影响
实验六蛋白质含量的测定
实验十四胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响
实验七去污剂对红血球细胞膜稳定性的影响
实验八盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
实验九动物组织核糖核酸的制备及测定
实验十脲酶Km值的简易测定
实验十一粗脂肪提取
实验十二 ATP的生物合成
实验十三动物肝脏RNA的制备(苯酚法)和纯度测定
实验一糖类的定量测定
—3,5-二硝基水杨酸比色定糖法
一、实验目的
,5一二硝基水杨酸法定糖的原理及方法。
,5一二硝基水杨酸比色法测定山芋粉中总糖。
。
二、实验原理
糖类的测定方法有物理方法和化学方法两类。
由于化学方法比较准确,常常使用之。还原糖的测定
是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基和酮
基的糖类。
3,5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内,棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此,我们可以利用比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。
该法是半微量定糖法,操作简便、快速,杂质干扰较少。
三、实验操作
(一)样品中总糖的水解及提取准确称取山芋粉1g,放入小三角烧瓶中,加入10ml6N HCL和15ml蒸馏水,混匀。在沸水浴加热30min后,用KI-I2溶液检查水解程度。若已水解完全,则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞试剂一滴,以10%NaOH中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml。再精确吸取上述溶液10ml,放入100ml容量瓶,稀释到刻度,备用。
(二)葡萄糖标准曲线的制作,取7支大试管分别按表1-1顺序加入各种试剂。
表1-1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量
项目
空白
1
2
3
4
5
6
含糖总量(mg)
0
葡萄糖液(ml)
0
蒸馏水(ml)
DNS试剂(m1)
加热
均在沸水浴中加热5min
冷却
立即用流动冷水冷却
蒸馏水(ml)
光密度()
将以上各管溶液混匀后,用分光光度计(520nm)进行比色测定,用空白管溶液调零点,记录光密度值,以葡萄糖浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制出标准曲线。一大组同学做一个标准曲线
(三)样品中含糖量的测定
取4支大试管,分别按表1—2加入各种试剂。
表1—2测定样品中含糖量时各试剂的用量
项目
空白
1
2
3
样品量(ml)
0
蒸馏水(ml)
DNS试剂(m1)
加热
均在沸水浴中加热5min
冷却
立即用流动冷水冷却
蒸馏水(ml)
光密度()
将各管混匀后,按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度,在标准曲线上查出相应的总糖含量,按下述公式计算出山芋粉总糖百分含量。
总糖=(水解后还原mg数×样品稀释倍数×100%)/样品重量
四、实验要求
,加入各种试剂量要准确。
,用干净的移液管吸取,用后盖好瓶塞,防回原处。
:溶液不要倒太多;毛边不要对着透光处;用后用自来水冲洗干净,防回原处。
:有色看外边缘,无色看中间凹处。
、试管、试剂瓶等,以防试剂污染仪器。
,须经实验老师检查并同意后,方可离开。
,方可离开。