文档介绍：第第2020章章细胞基因分离鉴细胞基因分离鉴
定和原位杂交定和原位杂交
第一节第一节细胞细胞DNADNA、、RNARNA的分离鉴定技术的分离鉴定技术
一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定
(一)DNA提取方法:获得的高纯度的DNA可以研
究结构、多态性、基因定位和鉴定、酶切序列
反应性。
(二)DNA纯度检测及含量计算(用紫外分光光度
计)OD260/.
DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50 μ g/L×稀
释倍数。
• DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体
积(mL)
• DNA分子量大小测定,可用含溴化乙锭的
1%琼脂凝胶电泳法测定,根据加入标准
品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子
量大小。
• DNA经不同的酶切后可用于序列酶切片段
分析和DNA图谱分析。
二、培养细胞总RNA 的提取及鉴定
(一)总RNA的提取方法:
• RNA纯度要求:为OD260/OD280=~2
• RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀
释倍数。
• RNA分子量大小:用甲醛+MOPS电泳缓冲
液电泳与标准分子量对比。
第二节第二节核酸蛋白转移电泳及杂交核酸蛋白转移电泳及杂交
一、DNA Southern Blot及杂交
(一)样品DNA内切酶水解
用两种以上不同的内切酶,要注意RE的最适盐
浓度,要由低向高逐级添加适量酶逐个进行
DNA切割。消化后的DNA直接进行琼脂糖电
泳Æ呈现不同大小片断条带。
•(二)Southern Blot及杂交
•将经电泳走在琼脂糖中的DNA条带变性、中
和后,以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至
硝酸纤维膜上,再用放射性探针检测与之杂
交的DNA条带。
•经洗膜、X片显影、定影,然后读片(如图
20-1)
•结果分析:此杂交技术可以对基因结构进行
分析。杂交阳性条带的大小,分布规律及根
据条带信号强度测量其含量。
二、RNA Northern Blot及杂交
•此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可
相互分离,随后将RNA分离条带转移至硝
酸纤维素滤膜上,用放射性标记的RNA或
DNA探针进行杂交经洗膜、X片显影、定
影,然后读片
•此结果可根据条带位置可判定RNA特定片
断的位置,也可测定其含量
•三、蛋白Western Blot及分析
•先经SDS-PAGE蛋白电泳分离的蛋白在凝胶上
分开后经丽春红S溶液中染色,在水中完全脱
色。,再如图20-2将胶上的蛋白杂带转移到硝
酸纤维素膜上,取出膜用含去脂奶粉封闭液处
理1-2小时,然后加入一抗作用1-2小时再加入
酶标记的二抗作用1-2小时再加入底物显色。
•可用于蛋白定性分析和相对表达量