文档介绍：第七节固定化酶 (Immobilized Enzyme)
酶在水溶液中不稳定,一般不能反复使用,而且不易与产物分离,不利于产物的提纯和精制。
针对这些限制酶广泛应用的因素,将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理,将酶束缚在一定的空间内,限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用,成为不溶于水的固定化的酶或细胞。
固定化酶的制备方法、性质、固定化酶反应器和应用
1953年,Grubhofev和Schleith首先开始了
酶固定化研究,并第一次实现了酶的固定化。
1960年,日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固
定化研究,开始了将固定酶应用在工业上的第
一步。
1969年,千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用
于DL-AA的光学分析,实现了酶连续反应的工业
化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。
1973年,千畑一郎再次在工业上成功地固定化
大肠杆菌细胞,成功实现了L-天冬氨酸连续生
产。
吸附法
包埋法
共价结合法
共价交联法
一、固定化酶(细胞)的制备方法
(一)、吸附法
吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的
次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触,再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术,在经济上也最具有吸引力.
根据吸附剂的特点又分为两种:
物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有:高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂,纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下,利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法(离子键)。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等;其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:
1. PH:影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。2. 离子强度:多方面的影响,一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度:若吸附剂的量固定,随蛋白质浓度
增加,吸附量也增加,直至饱和。
4. 温度:蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度:蛋白质在固体载体上的吸附速度要比
小分子慢得多。
6. 载体:对于非多孔性载体,则颗粒越小吸附力越
强。多孔性载体,要考虑吸附对象的大小
和总吸附面积的大小。
吸附法的优点:操作简单,可供选择的载体类型多,吸附过程可同时达到纯化和固化的目的,所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 吸附法的缺点:酶和载体的结合力不强,会导致催化活力的丧失和沾污反应产物;经验性强。 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析。
(二)、包埋法
包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。(如将聚合物的单体和酶溶液混合后,再借助聚合促进剂的作用进行聚合,将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的)。
1、凝胶包埋法: 将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法: 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合,然后加入聚合催化系统使之开始聚合,结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高,并可以改进酶脱落的情况,在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上,可以减少酶的脱落。 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体,它从海藻中提取出来,可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化,操作简单经济。 K-角叉莱胶(卡拉胶)冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性,机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 胶原和明胶也是常用的包埋载体。
2、微囊化包埋法
微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维
中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗,中空纤维
主要适于工业使用。
界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法,它是利
用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较
低而形成的皮膜将酶包埋。
界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所
得的微囊外观好,但不稳定,有些酶还会因在包
埋过程中发生化学反应而失活。