文档介绍：CIK细胞对白血病微小残留病作用的研究
作者：肖中平封韬王雪野韩梅肖中平
【摘要】目的观察CIK细胞对自体、异体原代白血病细胞的杀伤 作用，对GO期CD34+白血病细胞的细胞毒作用，及对正常骨髓造血 干细胞的影响。方法取急性白血病(AL)化疗后、慢性粒细胞白血病 (CML)慢性期及正常人外周血单个核细胞加入一系列细胞因子诱导培 养CIK细胞，流式细胞仪检测CIK表型，G带法分析CIK细胞核型。 冻存、复苏后作为靶细胞，MTT法测定CIK细胞对自体、异体原代白 血病细胞杀伤作用。A0染色法测定复苏后GO期急性粒细胞白血病 (AML) CD34+细胞比例及培养后CML CD34+细胞中GO期细胞比例。流 式细胞仪检测CIK细胞杀伤前后GO期CD34+细胞比例变化。半固体 培养法检测CIK细胞对正常骨髓CFU E集落形成的影响。 结果CIK细胞可从白血病患者外周血中获得，来源于正常淋巴细胞, 对自体原代白血病细胞有明显杀伤作用，对GO期白血病细胞有明显 抑制作用，对正常造血干细胞无杀伤作用。结论CIK细胞可作为清 除残留白血病细胞的有效工具。
【关键词】白血病；微小残留病；CIK细胞
完全缓解的白血病患者体内，常残存耐药的、处于静止期的微小残 留白血病细胞，是复发的根源。本研究从白血病患者外周血中培养出 的CIK细胞，不含有白血病干细胞，能有效杀伤GO期CD34+白血病 干细胞，而且这种杀伤作用具有选择性，不损伤正常造血干细胞，可 以作为有效的免疫细胞来清除白血病患者体内的为微小残留病 （MRD）,值得临床使用。
1材料和方法
1. 1对象
本院血液科2005年1月至2008年10月15例急性白血病（AL ） 治疗后完全缓解（CR）患者，5例慢性粒细胞白血病（CML）慢性期 患者，5例正常人。诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》〔1〕。
白介素（IL） 1,英国Pepro Tech INC公司；IL 2,沈阳 三生公司；CD3抗体，美国PharMingen公司；干扰素（IFN） y ,英 国 Pepro Tech INC 公司；CD3 FITC 单抗、CD56 PE 单抗、CD34
APC 单抗、IgG FITC 单抗、IgG PE 单抗，美国 PharMingen 公 司；EPICS XL流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司。
1. 3. 1 CIK细胞的培养与测定
(1) CIK细胞的诱导与培养：取15例AL化疗后CR患者、5 例CML患者、5例正常人外周血分离单个核细胞，第1天加入IFNy 1 000 M 1/ml,第 2 天加入 CD3 单抗 50 ng/mh IL 2 1 000 m 1/mh IL 1 100 n 1/ml,诱导培养CIK细胞。(2 )流式细胞仪(FCM)检测 CIK细胞表型：在培养至第1、2、3周时，分别取105 CIK细胞，标 记CD3 FITC单抗、CD56 PE单抗20 对照管加入IgG PE、
IgG FITC 20 uh避光孵育20 min,用PBS洗涤后，再加1 g/L 多聚甲醛固定，4€避光保存，1 w内上机检测。(3)染色体G带法 分析CIK细胞核型：取4例CML患者、1例APL患者外周血单个核细 胞培养至第3〜4周CIK细胞5 ml(lx 106/ml),加秋水仙胺至终浓度 0. 03 ng/ml,置于37°C、5% CO2孵箱中培育3 h后离心、低渗处理、 预固定、离心、固定、离心、再次固定、离心、再固定，制备中期染 色体标本，Gimsa染色后镜检及摄影。
CIK细胞对急、慢性白血病细胞的杀伤作用
(1)靶细胞(白血病细胞)制备：取上述患者初诊时骨髓5 ml, 肝素抗凝，以RPMI 1640按2 : 1体积混合稀释，将此稀释液缓慢加
入含有5 ml Ficol 1的离心管中，2 000 r/min离心20 min后吸取 单个核细胞层，以RPMI 1640清洗2次后，用含20%胎牛血清和10%DMSO 的1640作为冻存保护液，程序降温至-196°C液氮中保存。（2）靶细 胞（白血病细胞）复苏：从液氮中取出上述白血病细胞冻存管，迅速 放入37€水中，摇动使其尽快融化，吸出细胞悬液，注入离心管中， 加入10 ml培养液混匀，1 000 r/min离心10 min,吸弃上清液，再 重复用培养液洗1次；培养液稀释细胞至1 xl06/ml,接种于培养瓶 中，培养1〜2d,培养后台盼蓝拒染法计数活细胞＞95%后备用。（3） MTT法测定CIK细胞对原代急慢性白血病细胞杀伤作用：将白血病细 胞浓度调至lxl05/ml,效应细胞即CIK细胞浓度分别调至2 x 106/ml, 5 x 105/ml, 1 x 105/