文档介绍：第五章
分子生物学研究法
本章主要内容
一、重组DNA技术发展史上的重大事件
二、基因操作的主要技术原理
三、基因克隆的载体系统
四、基因的分离与鉴定
一、重组DNA技术发展史上的重大事件
,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题; ,解决了基因的自我复制和世代交替问题; ,相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。
重组DNA技术历史上的主要事件
(教材P148表)
基因工程的主要内容或步骤:
1. 从生物有机体基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞,并筛选出已经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。
DNA重组技术的基本过程
载体系统大肠杆菌质粒
外源DNA系统
内切核酸酶
内切核酸酶
“退火”
DNA连接酶
重组质粒
转化
受体系统
感受态细菌
复制
染色体
“工程菌”
重组质粒
在DNA重组技术中,一个重大发现是关于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的应用。
核酸内切酶Eco R I 能特异地识别GAATTC序列,在此切开DNA并形成粘性末端,还可把不同来源的DNA片段通过粘性末端之间的碱基互补而使其彼此“粘合”。
重组DNA技术常用的工具酶见教材149页表。
二、基因操作的主要技术原理
序:传统的方法--同位素标记、放射自显影技术的应用。
1. 核酸的凝胶电泳
    (1)基本原理:将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。
    在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是离子化的,所以,DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中,它就会由负极→正极移动。
(2)琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖:红色海藻产物提取的多糖聚合物,经化学修饰的低溶点琼脂糖结构脆弱,低温下易熔化。
凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。凝胶浓度与凝胶介质孔隙大小呈反比,与分辨力呈正比。
在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭(EB)染色( EB 能插入到DNA或RNA分子相邻碱基之间并在300nm波长紫外光下发出荧光)。此时,核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
(3)脉冲电场凝胶电泳(PFGE)
在脉冲电场中,DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而改变。
在标准PFGE中,第一个脉冲电场的方向与DNA移动方向成45度角,而第二个脉冲电场的方向与DNA移动方向在另一侧成45度角。(P155图)
PFGE技术用于分离大分子量的DNA。对于较大分子的DNA,常用更多的脉冲次数来更换其构型和方位以分离之。
2. 核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中,经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子,都是在杂交之前,通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜,叠氮苯氧甲基纤维素滤纸(DBM)和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤:    将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,这个过程特称为核酸印迹转移,主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法    将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。