间接免疫荧光讲.ppt

文档介绍：间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA)
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基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
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试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：，
荧光标记的抗体溶液：， 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（， 1500ml）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
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实验步骤
，，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. ，，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，，，，，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
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5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
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注意事项
对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色