文档介绍：第十二章基因工程下册 P580
12-1 基因工程
是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程,包括基因重组、克隆和表达。核心是构建重组体DNA的技术。
DNA克隆
将DNA限制酶切片段插入克隆载体,导入宿主细胞,经无性繁殖以获得相同的DNA扩增分子。
DNA限制酶和连接酶:
限制酶可将DNA切割成平末端或黏性末端,互补黏性末端之间碱基配可促使连接反应容易进行。
相容的限制片段可用DNA连接酶相连接,DNA的黏性末端和平末端连接见P582 图40-1。
分子克隆的载体与宿主系统:
载体:将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具。
克隆载体通常是由质粒、病毒(如λ-噬菌体)或一段染色体DNA改建而成。
质粒是染色体外自主复制的遗传因子,多为共价闭环DNA分子,常用作细菌与真菌的克隆载体。如用限制性酶切割环形质粒DNA,制备一个具黏性末端的开环质粒分子。
作为克隆载体应具有自主复制能力,有易于筛选的选择标记,如含有抗药基因等。
宿主细胞应根据载体的性质来选定,应易于接受外源DNA,且易于生长和筛选。
外源基因导入宿主细胞:
欲引入的外源目标DNA经限制酶切割后应与载体有同样的黏性末端,用连接酶将外源DNA片段和载体连接成外源基因。
用CaCl2等方法,使E. coli等宿主细胞处于感受态,从而将外源基因导入细胞。
此外还有电穿孔法等使外源DNA高效导入细胞。
最后分离筛选出带有目的基因的重组体并进行克隆(可按重组体某种特征,如抗药性选择、营养标记选择等在特定培养基上进行筛选后繁殖形成菌落。每个菌落的细胞将含有同样的重组质粒DNA,这些质粒DNA又含有同样外源DNA片段)。
基因文库
基因文库的构建: P589
基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。
理想情况下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。
基因文库的构建包括基因组DNA的随机片段化、载体DNA的制备、重组DNA的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤。
cDNA文库的构建:
真核生物基因是断裂的,需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。若将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA(cDNA),接上原核生物表达控制元件,在原核生物表达。
通过cDNA还可研究不稳定的mRNA。
cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
12-2 聚合酶链反应 P595
简称PCR(Polymerase Chain Reaction),为DNA体外酶促扩增,又称为无细胞分子克隆法。
PCR基本原理
将DNA聚合反应所需五大要素集中在体外缓冲液中,可合成与模板互补的DNA新链。
DNA聚合酶:可采用耐热的Tag DNA聚合酶。但Tag酶