文档介绍：生物工程专业核心课程
基因工程
华东理工大学张惠展
基因工程
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基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
3 基因工程的基本条件
C 用于基因转移的受体菌或细胞
B 用于基因克隆的载体
A 用于核酸操作的工具酶
A 用于核酸操作的工具酶
3 基因工程的基本条件
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
核酸酶
核酸修饰酶
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
识别双链DNA分子中的特定序列,并切割DNA双链
主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来DNA的入侵
细菌的限制与修饰作用
hsd R:编码限制性核酸内切酶
hsd M:编码限制性甲基化酶
hsd S:编码限制性酶和甲基化酶的协同表达
1968年,Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出
Hind II和Hind III
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的类型
主要特性 I 型 II 型 III 型
限制修饰
多功能
单功能
双功能
蛋白结构
异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子
ATP Mg2+ SAM
ATP Mg2+ SAM
Mg2+
识别序列
TGAN8TGCT
旋转对称序列
6GTGC
CAGCAG
切割位点
距识别序列1kb处
识别序列内或附近
距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的命名
属名种名株名
H i n d III H i n d III
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
5‘… G C T G A A T T C G A G … 3’
3‘… C G A C T T A A G C T C … 5’
EcoR I的识别序列
EcoR I的切割位点
EcoRI等产生的5‘粘性末端
5‘… G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘… C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
EcoRI 37 ℃
5‘… G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘… C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘… G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘… C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
OH
P
OH
P
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘… G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’
3‘… C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘… G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’
3‘… C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘… G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’
3‘… C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
OH
P
OH
P