文档介绍：3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
1)还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
2)还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在520nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。
三、试剂
1)1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
DNS和262mL 2M NaOH溶液,加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。
四、操作方法:(一)葡萄糖标准曲线的制定1)取九支试管,分别按下表加入试剂
项目
0
1
2
3
4
5
6
7
8
葡萄糖标准液(mL)
0

相当于葡萄糖量(mg)
0

蒸馏水(mL)

3,5-二消基水杨酸试剂(mL)

2)将各管溶液混匀,在沸水中加热5分钟,取出后立即用冷水冷却至室温,,摇匀。
3)于520nm波长处测A值。以葡萄糖mg数为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。
(二)样品中总糖和还原糖含量的测定
1)样品中还原糖的提取:准确称取2g山芋粉,放在100mL烧杯中,先以少量水调成糊状,然后加50-60mL蒸馏水,于50℃恒温水浴中保温20分钟,过滤,将滤液收集在100mL容量瓶中,再定容至100mL。
2)样品中总糖的水解及提取:准确称取1g山芋粉,放在锥形瓶中,加10mL6mol/L盐酸,15mL水,在沸水浴中加热半小时,取出一、二滴置于白瓷板上,加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂,以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色,过滤并定容到100mL。再精确吸取上述溶液10mL于100mL容量瓶中,定容至刻度,混匀备用。
3)样品中糖含量的测定:取7支试管分别按下表加入试剂:
项目
空白
还原糖
总糖
0
1
2
3
4
5
6
样品溶液(mL)
0

蒸馏水(mL)
2

3,5-二消基水杨酸(mL)

加完试剂后,其余操作与制作标准曲线时相同。