文档介绍：分子克隆工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割
DNA***化酶—用于DNA分子的***化
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接
核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰
其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
分子克隆工具酶及其应用
第一节 限制性内切核酸酶
分子克隆工具酶及其应用
一    . 限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现
Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现
H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。
分子克隆工具酶及其应用
二  . 限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上。
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶与***化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。
分子克隆工具酶及其应用
三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ
SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
分子克隆工具酶及其应用
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC
BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy
Not I GCGGCCGC；
SfiI GGCC N N N N N GGCC
CCGGN’N’N’N’N’CCGG
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起
２）富含ＧＣ
分子克隆工具酶及其应用
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2.  末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’ 3