文档介绍：Chapter7 Protein的分离、纯化和表征
一、Protein的酸碱性质
(一)Protein的两性解离★
1、主链上两个末端α—NH2和α—COOH的解离
2、侧链上基团的解离
(二)Protein的等电点(PI)
1、定义:使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等,即净电荷为零时的溶液的pH值称为PI(isoelectric point).
2、当pH值> PI 时,蛋白质带负电荷
当pH值<PI 时,蛋白质带正电荷
当pH值=PI 时,蛋白质带净电荷为零
3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质
电泳分离
正极移动
负极移动
不移动
电泳
二、Protein的高分子性质
1、稳定性因素(299页):(1)胶体性质(丁达尔现象、布郎运动);
(2)形成水化膜;(3)双电离层
2、通透性:不易透过半透膜,可用透析的方法将蛋白质分子与其它
小分子物质分离,纯化蛋白质。
3、沉降系数(S):蛋白质在一定的溶剂中,经超速离心沉降,单
位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数,它表示沉
降分子的大小特性。
三、Protein的变性与复性
1、定义:蛋白质在一定的理化因素的影响下,三维构象破坏,理化性质发生改变和生物学活性丧失,叫变性作用(denaturation)。其本质是高级结构破坏、一级结构不变。
蛋白质的复性:消除理化因素的影响,生物活性恢复或部分恢复。
加热凝固变性不可逆。
2、意义:生产和保存蛋白制品;消毒;提纯等应用。
四、Protein的沉淀(precipitation)
沉淀蛋白质的方法有
(一)盐溶盐析:中式盐,如硫酸铵,(降低蛋白质与水的亲和力);
(二)有机溶剂沉淀法:甲醇、乙醇、丙酮等(破坏蛋白质胶粒上的水化层);
(三)重金属盐沉淀法:产生重金属蛋白盐沉淀;
(四)生物碱试剂和某些酸类沉淀法:鞣酸、苦味酸、硝酸等
(五)加热变性沉淀法
五、Protein的颜色反应
(一)茚三酮反应:在pH5~7的溶液中,与茚三酮共热可产生蓝紫色物质,用于蛋白质的定性和定量。
(二)双缩脲反应:与双缩脲试剂(即碱性铜溶液)反应生成紫红色络合物,只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或蛋白质水解程度的测定。
(三)酚试剂反应:与酚试剂(磷钼酸—磷钨酸化合物)作用生成蓝色物质,再用比色法定性和定量,其灵敏度比双缩脲反应高100倍。
六、Protein吸收光谱的特点
Phe、Tyr、Trp 具有吸收紫外光的能力,最大的吸收峰为280nm处,此外,蛋白质分子中的肽键可引起200~220nm的最大光吸收,可用于蛋白质的定性和定量。
七、Protein分子的免疫学特性
免疫球蛋白的结构和功能◆
八、 Protein的分离纯化及鉴定
(一)Protein的提取(300页)
1、选材:
2、破碎:常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等机械破碎法。
3、提取:
(二)Protein的分离纯化
1、盐析法:中性盐分级沉淀法,常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同,盐析时所需的盐的浓度也不相同,因而可以将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法:净电荷为零,分子之间的静电排斥力最小,因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法:甲醇、乙醇、丙酮等(保持低温),破坏蛋白质的水化层,使蛋白质的溶解度降低而沉淀。
4、凝胶过滤(303页)(凝胶层析)(gel filtration chromatography):又叫分子筛层析,常用的凝胶有交联葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P)和琼脂糖凝胶(Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化,以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。
5、离子交换层析:
6、密度梯度(区带)离心:常用蔗糖密度梯度。
此外,有透析法、超过滤法、萃取法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳、超速离心、亲和层析等。
The End
蛋白质与氨基酸、多肽一样,能够发生两性解离(两性电解质),也有等电点(PI)。
阳离子交换剂本身带负电荷,阴离子交换剂本身带正电荷。(221页)
此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。
Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200
Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6B
Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400