文档介绍：第二章
基因操作的主要技术原理
核酸的凝胶电泳
扩增原理
分子杂交
测序
核酸的凝胶电泳
它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,同时也是分子生物学研究方法的技术基础。
基本原理
带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链,依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同,可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。
电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子,比分子量较大的DNA分子迁移率要快;同等分子量的不同构型的核酸分子,构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快
凝胶电泳的分辨力:
与凝胶的类型和密度相关
~50Kb之间;
聚丙烯酰胺的分辨力在1~1000bp之间
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。
分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼脂糖。
LMP琼脂糖
熔点:62~65℃
熔解后,在37℃可保持液态数小时;
在25℃可保持液态约10min
回收DNA分子
在65℃下将LMP琼脂糖凝胶熔化;
加入过量的酚抽提DNA;
离心获得含DNA分子的上清液;
直接酶切
琼脂糖凝胶电泳的参数:
缓冲液:1× TAE(TBE TPE)
凝胶的含量:根据检测的DNA大小
加DNA样品:<1μg,指示剂
电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短时间
染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB)染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。
μg的微量DNA
DNA的片断大小与荧光强度成正比