文档介绍：《基因工程概论》
第一章导论
第二章基因操作的工具酶
第三章基因克隆的载体
第四章基因克隆的策略
第五章克隆基因的表达
第六章基因工程的基本技术
第六章基因工程的基本技术
第一节 DNA的分离和检测
第二节 DNA聚合酶链式反应
第三节 DNA的序列分析
第四节植物转基因技术
质粒DNA的小量制备
将含有质粒DNA的大肠杆菌接种到LB培养基中(含有相应抗生素),在37℃下震荡培养过夜,这样质粒DNA便随着细菌的繁殖而得到了大量的扩增。当细菌培养物生长到对数晚期时,我们就可获得很高产量的质粒DNA。
通过离心收集细菌,用碱性溶液处理使得细菌细胞裂解,释放出其中的质粒DNA分子。在碱性条件下,宿主的线状染色体DNA发生变性,但是闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开,所以当条件恢复正常时,质粒DNA链迅速得到准确复位成为超螺旋分子。
通过离心去掉细胞碎片、染色体DNA和其它杂质,并将水相的质粒DNA分子用乙醇沉淀出来,最后溶于TE缓冲液或纯水中备用。
SDS法小量制备
植物基因组DNA的的原理
在含有去污剂SDS的溶液中,植物细胞会被裂解释放出细胞核中的基因组DNA,通过氯仿/异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂质,这时的基因组DNA分配在水相中。
然后用乙醇将水相的DNA分子沉淀出来,最后溶于TE缓冲液或纯水中备用。
剪取新鲜的植物叶片约20mg,;
向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片;
在液氮蒸发去2/3时,用自制研杵迅速磨碎叶片;
立即加入300uL 65℃预热的提取液摇匀,于65℃水浴约1hr,其间摇动数次;
加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀,于12000 rpm离心5分;
,加入2倍体积预冷的无水乙醇,混匀后静置2min,14000rpm离心5min;
倾去上清液并用200uL预冷乙醇(70%)清洗DNA沉淀,14000rpm离心5min;
用枪头小心吸去乙醇,自然风干DNA后溶于50uL ddH2O中,置-20℃保存备用。
植物基因组DNA的小量快速制备方案
DNA提取液的配方
Ingredient of the genomic DNA extracting solution
成分
Ingredient
工作浓度
working concentration
Tris·Cl()
100mM
EDTA()
5mM
NaCl
500mM
SDS
%
PVP
1%
DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
+
-
仪器
电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪;
药品
Agarose、 loading buffer、 TAE buffer、EB(溴化乙锭)、
上样缓冲液(6X)配方
% 溴酚蓝、%二甲苯氰醇、40%蔗糖;水溶液4℃保存。
第六章基因工程的基本技术
第一节 DNA的分离和检测
第二节 DNA聚合酶链式反应(PCR)
第三节 DNA的序列分析
第四节植物转基因技术
Polymerase Chain Reaction(PCR)
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