文档介绍：微生物实验技术
第四章
微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术
微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
实验4-2 紫外线诱变育种
实验4-3 微生物菌种的保藏方法
实验4-4 苏云金杆菌的虫体复壮
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
一、实验目的
1. 学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。
2. 学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。
二、实验原理
酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分,含酚污水的排放,污染水源、毒死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康,是各国研究关注的污染物之一。
含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为:假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
三、实验材料
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(固体、液体和斜面),耐酚细菌培养基(固体、液体和斜面) ,碳源对照培养液a,苯酚培养液b,见附录Ⅲ。
2% 4-氨基安替比林溶液,8%铁氰化钾溶液,氯仿,氨性氯化铵缓冲液,溴酸钾-溴化钾溶液,硫代硫酸钠溶液, 1%淀粉溶液,(见附录Ⅴ)。
,无菌培养皿,无菌移液管,测定酚所用的移液管,容量瓶,试剂瓶,酸式滴定管等。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
四、实验方法
自焦化厂、钢铁公司化工厂、造纸厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水,装于无菌瓶中,带回实验室,记录采样日期、地点,曝气池的水质分析包括:挥发酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化学需氧量、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等。采集的样品应迅速稀释分离。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
梯度平板制备:在无菌培养皿中,先倾倒7~l0mL不含苯酚的无菌细菌或真菌固体培养基,将培养皿一侧置于木条上,使皿中培养基倾斜成斜面,且刚好完全盖住培养皿底部,待培养基凝固后,将培养皿放平,再倒入无菌7~l0mL(刚好完全盖住下层斜面)含70mL/l00mL苯酚的无菌耐酚细菌或耐酚真菌固体培养基,刚好完全盖住下层斜面,放置过夜。由于苯酚的扩散作用,造成上层培养基由厚到薄的药物浓度递减的梯度(图4-1)。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
图4-1 梯度平板
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
涂布法分离:将采集的样品按涂布法分离,30℃培养2天后,平板上生长的菌落也形成密度梯度,苯酚低浓度区形成菌苔,苯酚高浓度区出现稀少菌落,将此菌落在含耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离,最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上,30℃培养2天。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
先将从含酚废水采集的活性污泥放入含酚量小于l00mg/L含酚废水中,%MgSO4·7H2O、%KH2PO4,30℃振荡培养6~7天,使苯酚降解菌大量增殖,淘汰对酚不适应的微生物;再流加含酚废水,使苯酚浓度增加至200mg/L,30℃振荡培养4~6天;再提高到流加250mg/L含酚废水,30℃培养4天,从中选出对酚耐受力强的菌株。
实验4-1 降解苯酚微生物的选育
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初筛:制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基,%、%、%、%,将选出的耐酚力强的的菌株在以上平板培养基上划线分离,自高酚浓度平板上长出的菌落,即为酚降解力高的菌株。
复筛:将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液a和苯酚培养液b中, 30℃振荡培养48h,0、12、24、36、48h取样测A600光密度值,绘制生长曲线,以不含酚的碳源(葡萄糖)培养液为对照。若与对照相比,在250mg/L苯酚浓度培养液中生长速度下降不明显,同时,用4-氨基安替比林法检测发酵初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度,计算降解率,若苯酚降解率达>80%,表明确系分离到有效苯酚降解菌。