文档介绍：使用大规模并行焦磷酸测序进行家蝇幼虫的转录组分析(Musca类)
摘要：我们应用罗氏454 - FLX平台进行大规模并行焦磷酸测序来生成家蝇的大量est序列，以此来研究家蝇幼虫的转录组和鉴定其特有的序列。结果我们获得了平均可读长度为373bp的总数为249，555的ESTs序列。其中有13,206个重叠区和20,556个单序列。使用Swissprot and Nr数据库的BlastX搜索引擎，我们可以鉴定4,814个重叠区和8,166个单序列的特有序列。随后，被注释的序列被用来作分析，搜索结果显示了大部分查询序列被被归于一定的基因本体论术语。此外，功能分类和途径分配被KEGG来展示，总共2,164个特有序列被映射到184KEGG途径。作为第一次关于家蝇大规模RNA测序的尝试，这个通用的转录组图片可以建立一个关于功能基因组进一步搜索的基本资源库。
介绍
Musca类(双:Muscidae),俗称苍蝇的,是一种主要国内、医疗和兽医害虫，能引起发炎、污染食品，是许多病源微生物体的载体。苍蝇的生活周期很短但高产，生活周期大约为18天，在此期间，雌性将产2,000枚卵。它们以任意的有机物质为生，包括正在分解的物质并通过食品污染将大量疾病传播给人类。超过100种与苍蝇有关的病原体可以对人类和动物致病。尽管其作为动物生理学和生物化学尤其是关于内分泌，滞育，繁殖，反抗压力和免疫方面是杰出的模型，但目前没有关于家蝇的基因组计划，此基因组资源受限。许多实验室已经进行了EST计划，例如减法杂交，已经有约900个家蝇的ESTs序列可以从NCBI免费获得。
转录组或est序列对于非模式生物来说是一条获得功能基因水平数据的行之有效的方法。对于整个基因组测序Est序列是很有效地转换，因为主要的真核生物的基因组大部分是是非编码的DNA,并且est序列缺乏内含子和内基因序列。Ests因此有丰富的功能信息并且适合于已知或预测功能。在基因注释和发现，比较基因组学，分子标记的拓展以及人口基因组研究的相关的遗传变异与自适应的特点方面，Est的序列的大量选择已被证明是无价的。尽管如此，至今，传统实验室关于est的发展包括基因克隆和cDNA文库建设费时费力，大部分实验室注重桑格测序法的加强。近年来，通过罗氏454平台进行的大规模并行焦磷酸测序已经成为决定性的有效地高通量测序法。这种新技术应用于基因组和转录组研究基因的发现。最近的研究显示对于以前没有的基因资源454的组装是非常成功的。如此大规模的生成序列数据将行使功能分析，这在以前是被限制在模式有机体的，此技术被快速的应用在重要的生态分类单元。这里，我们用cDNA的焦磷酸测序来描述家蝇的转录组。
材料与方法
苍蝇的保存和感染实验
家蝇被用在此实验是来自于中科院动物所的何凤琴女士的贡献。家蝇幼虫在下述的培养基中培养：麦麸(55克),热激酵母(3 g),牛奶
(150毫升),和抗真菌药物治疗对羟基苯甲酸甲酯(),培养到成蛹期。脱蛹后，成蝇用水，糖，奶粉喂养。苍蝇被保存在25℃光照黑暗各12小时周期的环境。我们用三龄幼体做脓毒的感染实验。脓毒症感染是由针注射到幼虫的腹部，注射以前把针浸入浓缩的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌里。在RNA提取前苍蝇应该在25℃环境下在新鲜培养基上保存12个小时。
RN