文档介绍：Western Blot 详解-常见的问题指南实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!): 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好? 解答:《抗体技术实验指南》和 Antibodies ( a laboratory manual , wrote by Ed Harlow , david lane )两本书不错。 2. 针对样品的常见问题 B. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot ( 以下简写成 Western Blot ), 提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂), 用的博士德的一抗, 开始还有点痕迹, 现在越来越差, 上样量已加到 120 μg, 换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗? 解答:怀疑是样品问题,可能是: 1 ,样品不能反复冻融; 2 ,样品未加蛋白酶抑制剂。同时, 建议检查 Western Blot 过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加 PMSF 就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 C. 细胞水平要做 western blot ,多少细胞提的蛋白够做 western blot ? 解答:一般 5× 10^6 就足够了 D. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白么?这样对 western blot 有无影响? 解答:能, 没有问题, 我们做过。 E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗? 解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。 F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么? 解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。 G. 我的样品的蛋白含量很低,每微升不到 1 微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上, 就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在, 只是颜色变淡了, 有什么办法可以解决? 解答: 你可以加大上样量, 没有问题, 还有转移时你可以用减少电流延长时间, 多加 5- 10 %甲醇。 H. 想分离的蛋白是分子量 260kd 的, SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作 Western Blot 吗? 解答: 260kd 的蛋白不好做, 分离胶用 6 %, Stacking Gel %。 I. 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载 30 %是不会有问题的。如果已经超了不少了, 而且小分子量的也要, 可以考虑加大胶的厚度, 可以试试 b 。 J. 蛋白变性后可以存放多久? 解答:- 80 ℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉( 也是被酶水解了)。 K. 我所测定的蛋白分子量是 105KD , 按理说分离胶应当采用 % , 但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用 11 %的配方,不知为何? 解答: 上述您提到的两种凝胶均可以使用, 因为 105 KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内, 但需注意条带位置。 L. 接下来我准备采用 DAB 显色技术,二抗是生物素化的多克隆"> 克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系, 不知采用这样的方案后, 封闭液是否要作调整, 能否再用 5 %的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗? 解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点. M. 还有一问题,一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗? 解答: Western Blot 一般上样 30 - 100 微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系, 也与显色时间长短有关。开始摸条件时, 为了拿到阳性结果, 各个步骤都可以量多一点时间长一点, 当然背景也就出来了。要拿到好的结果, 如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合 Western Blot 的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。 N. 做组织样品的 western 的时候, 处理样品有什么诀窍吗?还有, 您用过大牛血清做封闭剂吗? 浓度如何?效果是不是比 BSA 好一点? 解答: 必须进行研磨、匀浆、超声处理, 蛋白质溶解度会更好, 离心要充分, 膜蛋白需用更剧烈的方法抽提, 低丰度膜蛋白可能还要分步抽提( 超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂 cocktail ),封闭剂一般 5% 脱脂奶粉较常