文档介绍：蛋白质的检测与分析―― Western blot 详细操作步骤一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志,检测蛋白质的方法很多,除 ELISA 法外,也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意,故本法遂被延伸称为 Wester n (西)印迹法,该法能用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合,然后用另一种蛋自质, 如 135I 蛋白 A 或辣根过氧化物酶连接的山羊抗 IgG 检测已结合上去的抗体。本法所需时间 6 小时或过夜。(一) 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行,而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂 SDS 与某一还原剂并用,并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与 SDS 结合并因此而带负电荷,由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此 S DS 多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下,每克多肽约可结合 克去污剂,借助已知分子量的标准参照物,则可测算出多肽链的分子量。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行,其电泳槽缓冲液的 pH 值与离子强度不同于配胶缓冲液,当两电极间接通电流后, 凝胶中形成移动界面, 并带动加入凝胶的样品中所含的 SDS 多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后,复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力,故大大提高了 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornsstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和积层胶中含 Tris-Cl() , 上下槽缓冲液含 Tris 甘氨酸() , 分离胶中含 Tris-Cl() 的。系统中所有组分都含有 % 的 SDS(Laemmli,1970) , 样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚, 此处 pH 值较高, 有利于甘氨酸的离子化, 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后, SDS 多肽复合物成一电位和 pH 值均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。【材料】分离胶及积层胶溶液水饱和异丁醇 1× Tris ? Cl/SDS, 蛋白质分子量标准混合物 1× SDS 电泳缓冲液电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件 封边垫片 样品梳子 50 μl 微量进样器恒流电源【常用试剂】 1) 30% 丙烯酰胺/% N,N ’- 亚甲丙烯酰胺将 30 克丙烯酰胺和 克 N,N ’- 亚甲丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中,加热至 37 ℃溶解之,补加水至终体积为 100 ml 。 μm 微孔滤膜过滤除菌,查证该溶液 pH 应不大于 ,置棕色瓶中保存。小心: 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收, 其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和 N,N ’- 亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。 2)4× Tris ? Cl/SDS,, 在 300mlH O 中溶解 91g Tris 碱() ,用 1mol/L 调节 pH 至 , 补加 HO 至体积 500ml 。用 μm 滤膜过滤溶液,再加入 2g SDS[%(w/v)] ,于 4℃可保存 1 月。 3)4× Tris ? Cl/SDS,, 在 40mlH O 中溶解 Tris 碱() ,用 1mol/L 调节 pH 至 , 补加 HO 至体积 100ml 。用 μm 滤膜过滤溶液,再加入 SDS[%(w/v)] ,于 4℃可保存 1 月。 4)4× SDS 电泳缓冲液 Tris base g Glycerin g 20%SDS 20 ml 加水至总体积 1000ml 。应用时稀释 4 倍即为 1× SDS 电泳缓冲液(Tris ,Glycerin