核酸电泳与检测.ppt

文档介绍：核酸凝胶电泳
用于分离、鉴定和纯化DNA或RN***段
优点：
便于分离；便于检测；便于回收
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琼脂糖凝胶电泳是以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
(1)电荷效应
在 pH 值为 ～ 时， DNA分子在高于其等电点的溶液中,核酸分***基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
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(2)分子筛效应
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型。
分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；
同等分子量的不同构型的核酸分子，cccDNA＞IDNA＞ocDNA
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（3）DNA分子的大小
在凝胶中，DN***段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数值成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
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根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DN***段的大小
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如何提高核酸电泳的分辨率？
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（4）凝胶电泳的分辨力与凝胶的类型和密度相关
一、凝胶类型
～50Kb之间(＜20kb);可区分相差loobp的DN***段，
常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
2. 聚丙烯酰***凝胶用于分离5－500bp的片段;垂直装置进行电泳
效果好、分辨率极高，相差1bp的DN***断就能分开，能容纳相对大量的DNA
用于核苷酸多态性的分析
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不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb)
-10
-7
-6
-3
-2
二、凝胶的密度
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可以通过提高琼脂糖的浓度减小凝胶孔径来提高电泳分辨率。
或者改用聚丙烯酰***凝胶。
还可以降低跑电泳的电压，增大跑电泳的时间等。
如何提高核酸
电泳的分辨率？
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（1）DNA分子的大小：双链线状DNA分子迁移的速率与其碱基对数值近似成反比。样品分子越大，在通过胶孔时的摩擦阻滞力越大，泳动速度越慢。
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