文档介绍：在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因, 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA 。转化(Transformation) 是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R ˉ,Mˉ) ,它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法( 如电击法, CaCl2 , RbCl(KCl) 等化学试剂法) 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells) 。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant ,即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl) 法, RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高, 但 CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15 %的无菌甘油于-70 ℃保存(半年),因此 CaCl2 法为使用更广泛。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: :不要用经过多次转接或储于 4℃的培养菌,最好从- 70 ℃或-20 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的 OD600 来控制。 DH5 α菌株的 OD600 为 时,细胞密度在 5× 107 个/ml 左右( 不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 cDNA) 。转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。 1ng cDNA 即可使 50 μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下, DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5 %。 :所用的试剂,如 CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或 AR.) ,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新