文档介绍：实验八总氮量的测定——微量凯氏
(Micro-Kjeldahl)定氮法
【目的和要求】

,包括标准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等
【原理】
天然有机物(如蛋白质、核酸及氨其酸等)的含氮量用凯氏定氮法来测定。
当天然含氮有机物与浓硫酸共热时,分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢,可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之,其中硫酸铜为催化剂,硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。
消化完了后,在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液,使硫酸铵分解,放出氨。用水蒸汽蒸馏法,将氨蒸入过量标准无机酸溶液中,然后用标准碱溶液进行滴定,准确测定氨量,从而折算出含氮量。
以甘氨酸为例,该过程的化学反应如下:
测定时常用硼酸溶液收集氨,氨与溶液中的氢离子结全,生成铵离子,使溶液中氢离子浓离降低。然后再用强酸滴定,直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。
-。相对误差应小于±2%
【操作方法】
一、样品处理
血清样品:取人血或猪血(蛋白质样品含水量一般为10%~12%),放于离心管中,于冰箱中放置过夜,次日离心除去血凝块,上层黄色透明清液,即为血清。吸出1ml血清,加到50ml容量瓶中,用蒸馏水稀释到刻度,混匀备用。溶液如显浑浊,加少量氯化钠,再混匀。
固体样品:测定某一固体样品中的含氮量,是按100克该物质的的干重所含的氮克数来表示(%)。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细,在称量瓶中称入一定量的样品,再置于105℃的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内,待降至室温后称重。按上述操作,每烘干1小时后重复称量一次,直至两次称量数值不变,即达到恒重为止。
二、消化
准备4个50ml的凯氏烧瓶,并标号,向第1、2号烧瓶内各加入2ml稀释血清溶液(或4ml核酸制品溶液,或200mg固体粉末)。注意,用吸量管直接将溶液(或用试管加入固体样品)加至烧瓶底部,切勿沾于瓶品及瓶颈上。向3、4号烧瓶加入2ml水,作为空白对照,测量试剂中可能含有的微量含氮物质,以对样品进行校正。
在每个烧瓶中加入约300mg硫酸钾-硫酸铜混合物,再用量筒加入化学纯浓硫酸3ml,将以上4个烧瓶放到消化架上(见图4-1),(如无消化架,可将烧瓶放在置于通风橱内或通风处的电炉上)进行消化。接好抽气装置,调节煤气量。先用小火焰加热煮沸,首先看到烧瓶内物质碳化变黑,并产生大量泡沫,此时要特别注意,不能让黑色物质上升到烧瓶颈部,否则将严重地影响样品的测定结果。当混合物停止冒泡,蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时,将火焰调节到使瓶内液体微微沸腾。假如在瓶颈上发现有黑色颗粒,应小心地将烧瓶倾斜振摇,用消化液体将它冲洗下来,在消化中要时常转动烧瓶,使全部样品都侵泡在硫酸内,以便在微沸的硫酸含中不断消化,消化液在轻度迥流的状况下大约维持6~8小时(对于那些赖氨酸含量较高的蛋白质样品甚至需要12小时)。待消化液变成褐色后,为了加速完成消化,可将烧瓶取下,稍冷,将30%过氧化氢溶液1~2滴,加到瓶底消化液中,再继续消化,直到消化液由淡黄色变成清晰