文档介绍：1
会计学
DNA测序和表达谱研究
UniGene：
为了弄清EST间的关系，美国国立生物技术信息中心(NCBl)根据EST相似性比较进行聚类分析，形成数据库UniGene (
当前cDNA测序的趋势:
由对EST的随机测序，
转向全长cDNA的克隆和测序。
牛牛文库文档分享
全长cDNA
是功能基因组学和比较基因组学研究的基础，
有功能意义的全长cDNA可以申请专利，
因此，除研究部门外，大药厂和生物技术公司也投入重金进行研究和抢占专利。
目前大部分的全长基因有待于克隆。
随着人类基因组DNA测序的快速进展，众多EST可供利用，生物信息学手段的增多和cDNA文库构建技术的完善，使得能够获得转录物较长的全长cDNA和低转录基因。
牛牛文库文档分享
目前，美国NIH启动了全长cDNA计划—哺乳动物基因采集计划(Mammalian Gene Collection Project) ，加之其他国家的加入，大大加快了全长cDNA的识别和克隆工作。
中国的人类基因组计划起步较晚，但坚持“有所为，有所不为”的原则，充分利用自己的资源优势和研究基础，提出对特殊组织如造血细胞、神经内分泌细胞、树突状细胞、胚胎器官等,或疾病如白血病、肝癌等进行大规模EST测序,进行基因表达谱分析，同时完成1％人类全长cDNA的识别和克隆任务。
牛牛文库文档分享
(一)大规模EST测序流程
并非简单个别cDNA测序的累加，
是现代生物技术和现代管理方法的结合，
是生物学与计算机科学的结合。
大规模EST测序：
多采用流水线作业及计算机辅助管理系统。
主要步骤：
1)cDNA文库构建
2)DNA测序
3)信息处理和管理
4)生物信息学分析
牛牛文库文档分享
牛牛文库文档分享
1. cDNA文库构建
研究目的不同—采用不同的cDNA文库构建方法。
①表达谱分析：常规的cDNA文库，如：oligo-dT引物定向克隆cDNA文库或随机引物法构建cDNA文库；
②获得更多的全长cDNA：构建全长cDNA文库，如：smart-PCR和oligo-PCR；
③增加EST种类：均一化(normalized)cDNA文库；
④克隆不同状态(药物处理的不同时相、不同病理及疾病的不同发展阶段等)的相关基因：减式cDNA文库构建方法。
牛牛文库文档分享
(1)oligo-dT引物定向克隆cDNA文库
最常用、大多数cDNA文库构建的方法；
多数EST来自该文库。
主要步骤：
RNA和mRNA抽提，
以mRNA为模板用oligo-dT作反转录引物合成
cDNA第一链，
在DNA聚合酶I作用下合成第二链，
加上接头后定向装入λ噬菌体。
牛牛文库文档分享
(2)CapFinder-PCR/oligo-PCR文库
主要特点：
利用mRNA 5’帽状结构设计引物，
该引物含有oligo(G)以对应于帽状结构的脱氧胞嘧啶，反转录反应时易于合成含有全长的第一链cDNA，
用5’和3’引物(oligo-dT)进行PCR扩增获得双链DNA，
装入λ噬菌体。
该种文库含有较高比例的全长cDNA，
也适于样本量较少的组织构建cDNA文库。
牛牛文库文档分享
(3)均一化cDNA文库
特点：将低丰度表达基因识别和克隆出来
各个实验室所采取的具体方法不同，效果也不一致。
主要目的：
减少测序量，尽可能识别更多的基因尤其是低转录基因。
构建文库时：
通过控制PCR反应减少高丰度基因扩增，
或采用自身mRNA乳胶吸附方法减少高丰度mRNA；
构建cDNA后，
也可以通过杂交的方法去除部分高表达的基因，
或者通过循环杂交、吸附的方法去除已经测序基因。
牛牛文库文档分享