文档介绍：实验二植物可溶性蛋白质含量的测定植物生理生化实验植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标; 在研究每一种酶的作用时, 常以比活(酶活力单位/ mg蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。为什么要测定可溶性蛋白质常用的测定方法有哪些? 考马斯亮蓝 G-250 法紫外分光光度法Folin -酚法(这些方法灵敏度不同对物质的反应也不一样) 福林( Folin )-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,其中包括两步反应: 第一步是在碱性条件下,与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物; 第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原,生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物,颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm 比色测定的灵敏度比双缩脲法高 100 倍。由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为 5~100 μg蛋白质) 。一、原理: Folin 酚法: 灵敏度比双缩脲高 100 倍, 操作简单, 重复性好, 但也有不足点:试剂配制比较难、样品中若含有大量酚基、柠檬酸和巯基化合物均有干扰。所以, 如含酚类物质较高的试验材料就不宜用 Folin 酚法测定。考马斯亮法: 是一种染料结合法, 反应灵敏, 1 分钟内即可完成显色, 操作简便快速灵敏度比 Folin 酚高出 4倍, 但不足的是在蛋白质含量高时线性关系较差,重复性差。同时染料很容易吸附在比色杯上,操作中消不注意,误差很多。紫外分光光度法: 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键, 使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。优点: 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。不足点:测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。测定方法的选择植物生理生化测定方法有多种多样,要选择哪一种方法,这必须自己的分析材料来选择方法。实验二植物可溶性蛋白质含量的测定植物生理生化实验( Folin -酚法) 1、了解测定植物体内可溶性蛋白质的意义和用途; 2、了解可溶性蛋白质测定的几种方法,并比较其优缺点; 3、掌握斐林-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其要点; 4、掌握标准曲线的绘制方法,进一步熟练 722S 型分光光度计、离心机的使用方法; 植物生理生化实验仪器设备: 722S 分光光度计; 离心机;电子天平; 研钵;移液管; 普通试管;三角瓶等。 55%21% 24% 植物生理生化实验