文档介绍：1 实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应一、目的意义 1 、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2 、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。二、实验原理 1 、双缩脲反应当尿素加热到 180 ℃左右时,2 分子尿素发生缩合放出 1 分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键,因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出,双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应,因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2 、茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热, 产生蓝紫色化合物, 此反应为一切蛋白质及α- 氨基酸( 除脯氨酸和羟脯氨酸)所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。该反应十分灵敏, 1: 1500000 浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此,此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3 、黄色反应含有苯环侧链的(特别是含酪氨酸)蛋白质溶液与硝酸共热时,呈黄色(硝基化合物), 再加碱则变为橙黄色,此反应也称为黄蛋白反应。 OH +HNOHO NO +HO HO NO+NaOHO N OHOH2 三、仪器与试剂 1 、试剂(1) 蛋白质溶液:取 10mL 鸡蛋清, 用蒸馏水稀释至 100mL , 搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。(2) % 色氨酸溶液、 % 酪氨酸溶液、 % 脯氨酸溶液、 % 甘氨酸溶液、 % 苯酚溶液。(3) %茚三酮-乙醇溶液:称取 茚三酮,溶于 100mL 95 %乙醇。(4) 10% NaOH 溶液、 1 %硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2 、仪器:试管及试管夹、酒精灯。四、操作方法 1 、双缩脲反应(1) 取一支干燥试管, 加入少量尿素, 用微火加热使之熔化, 待熔化的尿素开始变硬时停止加热。此时, 尿素已缩合为双缩脲并放出氨气( 可由气味辨别)。待试管冷却, 加入约 1mL10 % NaOH 溶液,振荡使其溶解,再加入 1滴1 %硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取 1 支试管,加入 1mL 蛋白质溶液,再加入 2mL 10% NaOH 溶液摇匀,然后再加入 2 滴1 %的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。(3) 注意事项加入的硫酸铜不可过量,否则会产生蓝色的氢氧化铜,从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。(4) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。 2 、茚三酮反应(1) 取3 支试管, 分别加入蛋白质溶液、 % 脯氨酸溶液、 % 甘氨酸溶液各 1mL , 再加 %茚三酮- 乙醇溶液,混匀后在小火上加热煮沸 1- 2min ,放置冷却,观察颜色变化。(2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴 % 脯氨酸溶液、 % 甘氨酸溶液,风干后再在原处滴一滴 %茚三酮- 乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察斑点出现及其颜色。(3) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。 3、黄色反应向6 个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。管号123456 材料蛋白质溶液指甲头发 % 苯酚 % 色氨酸 % 酪氨酸加入量(滴) 4 少许少许 444 浓硝酸(滴) 22020444 酒精灯加热煮沸现象逐滴加 10%NaOH 后现象 3 实验二蛋白质的沉淀反应蛋白质是亲水胶体,当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后,即自溶液中沉淀析出(浑浊现象) ,此现象叫蛋白质的沉淀反应。(一)蛋白质的盐析作用一、目的意义了解盐析法及可逆沉淀的原理,学习用盐析法沉淀分离蛋白质。二、实验原理盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降,故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时,蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关: ①蛋白质分子被浓盐脱水; ②分子所带电荷被中和。盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加,实验时要加足够量的盐。蛋白质的盐析作用是可逆过程,用盐析方法沉淀蛋白质时,较少引起蛋白质变性,经透析或用水稀释时又可溶解。三、仪器与试剂 1 、试剂⑴蛋白质溶液:取 10mL 鸡蛋清, 用蒸馏水稀释至 100mL , 搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。⑵饱和硫酸铵溶液; ⑶ 10% 氢氧化钠溶液; ⑷ 1% 硫酸铜溶液。四、操作方法 1、取蛋白质溶液约 2 mL 于试管中, 加入过量的饱和硫酸铵溶液, 混匀后静置 3 分钟则析出沉淀。(二)重金属盐类沉淀蛋白质一、目的意义了解重金属盐类沉淀法的原理,学习用重金属盐类沉淀法沉淀分离蛋白质。二、实验原理溶液 pH 在蛋白质等电点以上时,重金属盐类(如 Pb 2+、 Cu 2+、 Hg 2+及 Ag + 等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全,