文档介绍：绿色荧光蛋白的应用 09化学制药 0932220026 唐骏 2008 年的诺贝化学奖由日本科学家下村修( Osamu Shimomura ) 、美国科学家马丁· 沙尔菲( Martin Chalfie )和美籍华裔科学家钱永健( Roger Y. Tsien )因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而共同获得。绿色荧光蛋白(green f luo rescen tp ro tein,GFP) 是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时, GFP 发射绿色荧光。近年来, 随着 GFP 在各种异源细胞, 如细菌、昆虫及植物细胞中的表达, GFP 作为一种新型的报告物在生物学界引起了广泛的关注, 关于它的基本结构、生色团、发光机理及基因的改造均有大量的研究报道。它是一种操作方便, 不用加外源底物, 就能在活细胞中检测的分子探针。将彻底改观过去标记方面的研究方法, 在分子生物学研究中有广阔的应用前景。关键词:绿色荧光蛋白转基因技术绿色荧光蛋白的发现与发展 1962 年, 下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道, 他们分离纯化了维多利亚多管水母中的发光蛋白—水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时, 有天下班前, 他将产物倒进水池里。临出门前关灯, 回望了一眼水池, 见到水池闪闪发光。因为水池也排放有养鱼缸的水, 他怀疑是鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后, 他便确定钙离子能增强光蛋白发光。绿色荧光蛋白被发现 20 多年后,才有人将其应用在生物样品标记上。 1993 年,马丁·沙尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物( 如大肠杆菌等)也能产生绿色荧光蛋白, 这不仅证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性, 还建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基该方法, 而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此, 生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。后来,美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理, 并对它进行了大刀阔斧的化学改造, 不但大大增强了它的发光效率, 还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白,使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱,供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白,大部分是钱永健改造的变种。 1 GFP 在转基因研究中的应用特点目前转基因研究与应用的发展十分迅速,将 GFP 基因应用到转基因研究中,具有其它基因所无法比拟的以下诸多优点。 荧光稳定,易于检测 GFP 的荧光较稳定,抗光漂白能力比荧光素强,能耐受较长时间的光照。 GFP 在 pH7 — 12 范围内都能正常发光; 对高温(70 %)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶等都有较强抗性"】。 GFP 中的发色团是由其一级结构中的一段三肽自然形成,该发色团的形成只需要氧气, 不依赖于酶或者其它辅助因子, 仅以紫外光或蓝光激发, 即可发出绿色荧光。用肉眼、荧光显微镜均可以观察到。且灵敏度高,还可进行表达量的半定量或定量检测。另外, GFP 中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体,且增强了荧光强度,适合在不同物种中专性表达。 Tsien 卜川发展了颜色迥异的 GFP 突变体, 包括蓝色荧光蛋白 BFP(blue fluorescent protein) 、青色荧光蛋白 CFP(eyan fluo